ABC轉(zhuǎn)運蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)研究.pdf

1、腫瘤是危害人類健康的重大疾病，在腫瘤的治療中，多藥耐藥現(xiàn)象一直是限制腫瘤化療成功的主要原因。引起腫瘤多藥耐藥的機(jī)制非常復(fù)雜，其中ABC轉(zhuǎn)運蛋白所介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥備受關(guān)注。 ABC轉(zhuǎn)運蛋白全稱為ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運蛋白(ATPBindingCassetteTransporters)，它們能夠介導(dǎo)多種底物分子在細(xì)胞內(nèi)外的運輸。研究發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運蛋白的泵功能與腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物聚集的降低有關(guān)，能夠使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性(Multidr

2、ugresistance，MDR)從而導(dǎo)致化療失敗。而隨著腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的提出，更認(rèn)為在化療中，腫瘤干細(xì)胞上轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)增強(qiáng)，對藥物外排的增加使腫瘤逃避化療藥物攻擊，存活并復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。其中尤以ABCG2更受到人們關(guān)注，認(rèn)為它不僅是耐藥蛋白，同時也可能是干細(xì)胞的潛在標(biāo)志物。 鼻咽癌是我國南方常見的上皮性惡性腫瘤。高發(fā)地區(qū)的發(fā)病率可達(dá)14.68-18.53/10萬人口，死亡率為12.46/10萬人口。在鼻咽癌的治療中，由于就診病人多

3、為中晚期患者，單純的放療不能有效緩解臨床癥狀，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率很高，因此必須結(jié)合有效的化療。而研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌中存在多藥耐藥的現(xiàn)象，是鼻咽癌化療效果無法進(jìn)一步提高的主要原因。因此檢測與耐藥相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運蛋白在鼻咽癌細(xì)胞株及組織中的表達(dá)情況，初步探討鼻咽癌中多藥耐藥的機(jī)制，是非常有意義的。 采用SYBRGreenⅠQRT-PCR(quantitatierealtimePCR)技術(shù)對靶基因進(jìn)行實時熒光定量分析是近年來發(fā)展起來的

4、一項新技術(shù)。SYBRGreenⅠ是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光染料。因此，它的熒光信號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系中存在的雙鏈DNA數(shù)量，并且通過熔解曲線的分析，排除非特異性擴(kuò)增的干擾，對靶基因進(jìn)行定量分析，準(zhǔn)確性和靈敏性都比普通RT-PCR高。通過2-△△CT方法利用SYBRGreenⅠQRT-PCR技術(shù)能夠很好的分析基因表達(dá)相對差異。用2-△△CT統(tǒng)計分析基因表達(dá)相對定量的方法在很多文獻(xiàn)中有報道，

5、由于這種方法無需做標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此比絕對定量方法更加簡便可行。 目前國內(nèi)外關(guān)于ABC轉(zhuǎn)運蛋白在鼻咽癌中的研究并不多見，并且多是采用免疫組化方法從蛋白水平研究多藥耐藥蛋白MDR1(ABCB1基因編碼)和多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1(ABCC1基因編碼)的文章，對于ABC轉(zhuǎn)運蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)情況缺乏系統(tǒng)了解。因此，我們采用準(zhǔn)確性和靈敏性較高的QRT-PCR技術(shù)檢測了ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族中十個與耐藥密切相關(guān)的成員(ABCA2、ABCB1、

6、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCC6、ABCC11、ABCG2)在鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2、HNE-1以及25例鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，并以一個含多例鼻咽正常組織的混合RNA作為正常對照，通過2-△△CT方法和t檢驗分析了十種基因在鼻咽癌細(xì)胞株、鼻咽癌組織與鼻咽正常組織中的表達(dá)差異；同時我們用化療藥物順鉑作用于鼻咽癌細(xì)胞株5-8F，比較了其在藥物誘導(dǎo)前后ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)

7、的變化。此外，還采用原位雜交檢測方法對ABCG2基因在鼻咽癌組織中的表達(dá)進(jìn)行了定位分析。 熒光實時定量PCR的結(jié)果表明在鼻咽癌細(xì)胞株中，ABCA2、ABCC1、ABCC2和ABCC3均為高表達(dá)，ABCG2在五種細(xì)胞株中均穩(wěn)定低表達(dá)，而經(jīng)典耐藥蛋白MDR的編碼基因ABCB1的表達(dá)則非常低，僅6-10B細(xì)胞中有極低表達(dá)。在25例鼻咽癌組織中，ABCA2、ABCC1和ABCC3也有較高的表達(dá)，其△Ct值均＜10，而ABCG2表達(dá)量較低

8、，25例組織中20例均為低表達(dá)。再通過2-△△Ct的方法分別比較了ABC轉(zhuǎn)運蛋白在鼻咽癌組織、鼻咽癌細(xì)胞株與正常鼻咽組織中的相對表達(dá)差異，我們發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織和鼻咽癌細(xì)胞株中ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)水平相對與正常鼻咽組織具有一致性，即ABCA2、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5以及ABCG2的表達(dá)均高于其在正常鼻咽組織中的表達(dá)，而ABCC6、ABCC11和ABCB1都低于其在正常鼻咽組織中的表達(dá)。通過T-test檢驗

9、，我們得到了ABCC1、ABCC2、ABCC4、ABCC5和ABCG2這五個基因在鼻咽癌組織中的表達(dá)要顯著高于其在正常鼻咽組織中的表達(dá)(P＜0.05)。 同時，我們檢測經(jīng)順鉑誘導(dǎo)后5-8F細(xì)胞株中ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果提示ABCC1和ABCC4這兩種基因的表達(dá)上調(diào)是比較明顯的，分別比未經(jīng)順鉑誘導(dǎo)的5-8F細(xì)胞株中這兩種基因的表達(dá)升高了3.05倍和8.16倍。 對ABCG2基因在鼻咽癌組織中的原位雜交結(jié)果顯示，AB

10、CG2基因的表達(dá)定位于鼻咽癌實質(zhì)細(xì)胞，在淋巴細(xì)胞和間質(zhì)中沒有表達(dá)；在所檢測的36例鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌中，ABCG2表達(dá)陽性的有6例。 根據(jù)實驗結(jié)果，我們把這十種ABC蛋白的表達(dá)情況分為三類，第一類是在鼻咽癌組織和正常鼻咽組織中都高表達(dá)的基因，包括ABCA2、ABCC1和ABCC3，其中ABCA2和ABCC3在鼻咽癌組織和正常鼻咽組織中的表達(dá)沒有顯著差異，而ABCC1在腫瘤組織中的表達(dá)則要明顯高于其在正常組織中的表達(dá)，并且ABC

11、C1編碼的多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1的高表達(dá)是導(dǎo)致許多腫瘤內(nèi)在性耐藥的原因，因此這提示鼻咽癌也存在天然耐藥性，當(dāng)使用的化療藥物為這些轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運底物時，它們對鼻咽癌的化療效果是非常差的。 第二類是在正常鼻咽組織中低表達(dá)而在鼻咽癌中表達(dá)顯著升高的，比如ABCC2、ABCC4、ABCC5和ABCG2，因此它們在鼻咽癌的耐藥中可能起著重要作用。其中ABCG2基因我們同時用了QRT-PCR和原位雜交方法相結(jié)合來檢測，結(jié)果顯示它的表達(dá)量在