EB病毒重組抗原Rta蛋白的表達及其在鼻咽癌篩查中的應(yīng)用.pdf

1、研究背景：
　　 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種常見的惡性腫瘤，好發(fā)于中國南方，尤以廣東省最多見。15年來發(fā)病率和死亡率一直高居不下(發(fā)病率：9.83-11.88/10萬，死亡率：10-13/10萬)。目前鼻咽癌病因尚不明確，且原發(fā)部位隱蔽，臨床癥狀無明顯特征性，許多患者就診時已到疾病中晚期，從而延誤了病情，錯過了最佳治療時機?；罱M織病理學(xué)檢查是確診NPC的唯一手段，但取樣過程的繁瑣與痛

2、苦致多數(shù)潛在患者不愿接受檢查。尋找病理診斷以外的一種準確、安全、簡便、經(jīng)濟、易為患者接受的篩查手段是目前亟待解決的問題。通過篩查，我們可以早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷和及時治療鼻咽癌，使鼻咽癌患者的生存率和生存質(zhì)量得到顯著提高。
　　 自1969年由鼻咽癌活檢組織培養(yǎng)出的類淋巴母細胞中分離到EB病毒以來，大量研究結(jié)果表明EB病毒是鼻咽癌重要的誘發(fā)因子，并且在鼻咽癌患者體內(nèi)經(jīng)常存在升高的抗EB病毒不同抗原的特異性抗體。長期以來EB病毒感染的

3、血清學(xué)檢測就被用作鼻咽癌篩查及早期診斷的重要手段被廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的EB病毒血清學(xué)檢測指標有EB病毒相關(guān)核抗原(EBvirus associated nuclear antigen，EBNA1)；分裂復(fù)制期表達的早期抗原(early antigen，EA)和病毒殼抗原(virus capsid antigen，VCA)等。這些抗原所建立的ELISA檢測方法快速、簡便、適用于大批量標本的的測定，但由于靈敏度、特異性等方面不盡人意，目前有單個

4、EB病毒血清學(xué)指標尚未能夠早期診斷鼻咽癌。為此，建立一個靈敏度高、特異性強的ELISA檢測方案來篩查和診斷鼻咽癌成為當前迫切需要解決的問題。
　　 EB病毒裂解期即刻早期基因BRLF1的表達產(chǎn)物Rta蛋白在病毒從潛伏期感染進入裂解期復(fù)制過程中起了重要作用，且只在腫瘤細胞中表達的特性使其成為鼻咽癌的特異性腫瘤標記物。為此，本研究利用真核表達體系表達Rta蛋白作為包被抗原檢測血清中的特異性抗體，探討其在鼻咽癌早期診斷中的應(yīng)用。

5、>　　 目的：
　　 1.探討EB病毒即刻早期基因BRLF1的表達產(chǎn)物Rta蛋白對鼻咽癌篩查和早期診斷的應(yīng)用價值。
　　 2.構(gòu)建Rta蛋白的真核表達載體并在畢赤酵母中進行分泌表達。
　　 3.以純化的重組蛋白建立ELISA方法用于鼻咽癌高危人群的檢測。
　　 方法：
　　 1.培養(yǎng)細胞B95-8，提取EB病毒基因組DNA作為擴增模板，設(shè)計一對引物擴增BRLF1編碼區(qū)全長序列。
　　 2

6、.構(gòu)建重組質(zhì)粒PpICZαA-BRLF1；電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，篩選His+Mut+表型轉(zhuǎn)化子并用甲醇誘導(dǎo)表達。
　　 3.采用商品化的IDAHis.Bind預(yù)裝柱純化試劑盒純化目的蛋白并作Western-blot檢測其免疫活性。
　　 4.將純化蛋白Rta包被酶標板，建立抗IgG/Rta抗體的ELISA檢測方法；收集300例鼻咽癌患者和200例健康對照人群血清進行檢測并對檢測結(jié)果做統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果：

7、
　　 1.構(gòu)建了pPICZ αA-BRLF1重組質(zhì)粒。
　　 2.目的蛋白在畢赤酵母GS115中高效分泌表達。
　　 3.SDS-PAGE在66.OKD處顯示有相應(yīng)目的條帶，同時Western-blot也證明其有良好的免疫活性。
　　 4.純化的目的蛋白行ELISA分別檢測鼻咽癌患者與正常人群血清，顯示有較佳的敏感性和特異性分別為92.7％和94.6％。
　　 結(jié)論：
　　 1.畢赤酵母