EB病毒早期彌散型抗原的畢赤酵母表達及其在鼻咽癌篩查中的應(yīng)用.pdf

1、[研究背景] 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種常見的惡性腫瘤，好發(fā)于中國南方，尤以廣東省最多見。15年來發(fā)病率和死亡率一直居高不下(發(fā)病率：9.83-11.88/10萬，死亡率：10-13/10萬)。目前鼻咽癌病因尚不明確，無確實可行的一級預(yù)防措施，故對鼻咽癌的防治目前主要寄希望于二級預(yù)防。篩查作為惡性腫瘤二級預(yù)防的主要手段在鼻咽癌的防治中作用重大，通過篩查，我們可以早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷和早

2、期治療鼻咽癌，使鼻咽癌患者的5年生存率得到顯著提高。因此尋找一種高效，方便快捷，經(jīng)濟的鼻咽癌篩查手段是十分重要且迫切的。 自1967年Helen在鼻咽癌病人的血清中發(fā)現(xiàn)EB病毒(Epstein—barr virus，EBV)特異性IgA抗體，1969年由鼻咽癌活檢組織培養(yǎng)出的類淋巴母細胞中分離到EB病毒以來，大量研究結(jié)果表明EB病毒是鼻咽癌重要的誘發(fā)因子，并且在鼻咽癌患者體內(nèi)經(jīng)常存在升高的抗EB病毒不同抗原的特異性抗體。長期以來

3、EB病毒感染的血清學檢測就被用作鼻咽癌早期診斷的重要手段被廣泛應(yīng)用，其中對診斷鼻咽癌最具意義的EB病毒蛋白主要有：EB病毒殼抗原(VCA)，早期抗原(EA)，核心抗原(NA1)和潛伏膜蛋白2A(LMP2A)等。 EB病毒早期抗原(early antigen，EA)對鼻咽癌的診斷最具特異性，被認為是鼻咽癌特異性的標志，抗IgA/EA抗體的檢測長期以來就被作為診斷鼻咽癌的輔助指標。EA是EB病毒早期抗原(early antigen

4、)的縮寫，由EB病毒早期彌散型抗原(EA—D)和局限型抗原(EA—R)兩種物質(zhì)組成的復(fù)合物，但在鼻咽癌患者血清中EA抗原IgA類抗體主要是與D型EA產(chǎn)生特異性反應(yīng)，因此有的學者認為建立D型EA為主的EA抗原IgA類抗體的血清學檢測手段對提高鼻咽癌早期診斷的準確率十分的重要。早期抗IgA/EA抗體檢測的方法主要有免疫熒光法(fluoroimm unoassay，F(xiàn)IA)，免疫酶法(immunoenzymatic assay，IE)等，但是

5、由于操作繁瑣，特異性差且需要特殊儀器，結(jié)果讀取存在主觀差異等缺點給鼻咽癌的篩查帶來一定的困難。ELISA作為一種新型的檢測方法克服了以上缺點顯示出極大的優(yōu)越性受到人們的關(guān)注，逐漸被許多學者應(yīng)用和探討。 [研究目的] 針對目前抗IgA/EA抗體檢測的ELISA試劑盒中尚無EA抗原以真核表達產(chǎn)物作為包被抗原者，作為對現(xiàn)有試劑盒的改進，本實驗構(gòu)建EA—D(P54)的真核表達載體并在畢赤酵母中進行分泌表達。以純化的重組蛋白建立初

6、步間接ELISA方法，開發(fā)鼻咽癌早期診斷試劑盒，用于鼻咽癌的大規(guī)模篩查。 [研究方法] 培養(yǎng)細胞B95-8，提取EB病毒基因組DNA作為擴增模板，設(shè)計一對引物擴增BMRF1基因片段編碼區(qū)域序列；構(gòu)建重組質(zhì)粒PpICZα A—BMRF1；電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，篩選His+ Mut+表型轉(zhuǎn)化子并用甲醇誘導(dǎo)表達；飽和硫酸銨分級鹽析純化目的蛋白；純化目的蛋白做Western—blot檢測免疫活性；并包被酶標板，建立抗IgA/

7、EA—D抗體的ELISA檢測方法；收集300例鼻咽癌患者和200例健康對照人群血清，進行檢測并對檢測結(jié)果做統(tǒng)計學分析。主要步驟入下： 1.B95-8細胞的培養(yǎng)及其基因組DNA的提取 B95-8細胞用含有10％FCS，100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，每周換液兩次。收取對數(shù)增殖期細胞，采用傳統(tǒng)的酚—氯仿—異丙醇方法提取其基因組DNA，用滅菌水溶解，于—

8、20℃保存?zhèn)溆谩?2.PCR擴增目的片段 按照GenBank發(fā)表的B95-8細胞中EB病毒株BMRF1基因片段編碼區(qū)的參考序列，以及載體pPICZα A的多克隆酶切位點，參考引物設(shè)計軟件PrimerPrimer5.0設(shè)計一對引物： P1：5'CGGAATTCATGGAAACCACTCAGAC3'含Eco RⅠ酶切位點； P2：5'GCGGATCCGATGGTGTTAATTGAGG3’含KpnⅠ的酶切位

9、點；以EB病毒基因組DNA作為模板PCR擴增目的片段。 3.重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 膠回收PCR產(chǎn)物，并與載體pPICZα A分別用Eco RⅠ和KpnⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳，回收后T4DNA連接酶4℃連接過夜，將過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，在含Zeocin(終濃度25ug/ml)的低鹽LB平板上篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，做雙酶切電泳鑒定及DNA測序。 4.重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)酵母細胞 鑒定正確的重組質(zhì)

10、粒用SacⅠ內(nèi)切酶線性化并電轉(zhuǎn)入GS115酵母細胞，于含Zeocin(終濃度100ug/ml/)的YPDS平板上篩選。所得陽性克隆用MMH板和MDH板篩選Mut表型，篩選在MMH和MDH平板上生長均良好的Mut+表型菌株作為表達菌，同時將篩選好的表達菌破壁做PCR擴增進一步鑒定轉(zhuǎn)化子。 5.重組蛋白的誘導(dǎo)： 將鑒定好的表達菌挑取少量，接種于BMGY中培養(yǎng)增菌，待A600達到2-6(約16-18小時)，換入1/5體積的BM

11、MY液體培養(yǎng)基中，以0.5％的甲醇終濃度誘導(dǎo)表達24、48、72、84、96小時。 6.重組蛋白的純化及其濃度測定： 從誘導(dǎo)第24小時開始，于每個誘導(dǎo)時間每分別取少量上清點樣做SDS—PAGE分析；并用誘導(dǎo)上清包被聚丙乙烯板條行間接ELISA檢測，測定重組蛋白的抗原效價；于抗原效價最佳時回收上清，用0.22μ m的膜過濾后，經(jīng)35％PEG(6000)，4℃透析濃縮；濃縮后的誘導(dǎo)上清進行飽和硫酸銨分級鹽析，純化目的蛋白，備

12、用；并用BCA蛋白定量測定法測定重組蛋白溶液的最終濃度。 7.Westernblot檢測重組蛋白的免疫學活性。 8.ELISA法檢測鼻咽癌病人及其健康對照的血清 1)抗原包被量的確定： 選擇方陣滴定確定最佳重組蛋白包被濃度。 2)臨界值的確定： 選擇ROC曲線法確定臨界值。 3)靈敏度，特異度的計算： 靈敏度=A/(A+B)；特異度=D/(C+D)；其中A為鼻咽癌患者陽性例

13、數(shù)，B為鼻咽癌患者陰性例數(shù)，C為健康人陽性例數(shù)，D為健康人陰性例數(shù)。 [研究結(jié)果] 構(gòu)建了pPICZα A—BMRF1重組質(zhì)粒；目的蛋白在畢赤酵母GS115中高效分泌表達；SDS—PAGE在58KD處顯示有相應(yīng)目的條帶；同時Western—blot也證明其有良好的免疫活性；純化目的蛋白行間接ELISA分別檢測鼻咽癌患者與正常人群血清，顯示有較佳的敏感性和特異性分別為92.7％和94.5％。 [研究結(jié)論]