鼻咽癌中EB病毒潛伏膜蛋白1和熱休克蛋白90β的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分兩部分;1.熱休克蛋白90β(HSP90β)在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其意義目的熱休克蛋白是一種腫瘤相關(guān)抗原，在腫瘤組織中的表達(dá)水平一般較高，其中HSP70、HSP90和gp96與腫瘤的關(guān)系最為密切。研究發(fā)現(xiàn)，HSP90β與腫瘤的分化程度有關(guān)，鑒于鼻咽癌98％為低分化鱗癌，分化差，惡性程度高，考慮HSP90β在鼻咽癌組織中應(yīng)高表達(dá)，但有關(guān)鼻咽癌組織中HSP90β的表達(dá)情況經(jīng)查閱文獻(xiàn)未見報(bào)道。所以本部分實(shí)驗(yàn)擬用免疫組化檢測HSP90β

2、在人鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，分析其在鼻咽癌組織分級和預(yù)后中的意義，為鼻咽癌的預(yù)后判斷尋找較為可靠的生物學(xué)指標(biāo)。方法應(yīng)用免疫組化SP法檢測50例鼻咽癌組織中HSP90β的表達(dá)情況，經(jīng)X2檢驗(yàn)對資料進(jìn)行處理，分析其表達(dá)與鼻咽癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果鼻咽癌組織中HSP90β高表達(dá)，陽性率明顯高于鼻咽部炎性組織；隨著鼻咽癌分化程度的降低，HSP90β的陽性表達(dá)率升高。結(jié)論HSP90β高表達(dá)可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有關(guān)；HSP90β的測定有可能

3、作為估計(jì)鼻咽癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一。 12.鼻咽癌中EBV-LMP1、HsP9oβ實(shí)驗(yàn)研究目的鼻咽癌是頭頸腫瘤中以轉(zhuǎn)移和侵襲能力強(qiáng)著稱的腫瘤，盡管原發(fā)癌對放療敏感，但大部分患者仍死于轉(zhuǎn)移，研究顯示鼻咽癌確診時(shí)，已有60％-85％患者在局部淋巴結(jié)、遠(yuǎn)處器官檢測到轉(zhuǎn)移灶，到目前為止對轉(zhuǎn)移階段的鼻咽癌尚無有效的治療方法，結(jié)果導(dǎo)致鼻咽癌的預(yù)后差，5年生存率不到50％，所以需要尋找其他治療方法。近年來，腫瘤的免疫治療已顯示出很好的應(yīng)用前景，

4、并且已在多種腫瘤中顯示了良好的應(yīng)用效果。但到目前為止鼻咽癌本身的腫瘤抗原仍是空白，而EB病毒與鼻咽癌關(guān)系密切，EB病毒LMP1是EB病毒誘發(fā)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫的刺激原和靶抗原，而且在鼻咽癌腫瘤細(xì)胞株中存在著晚期潛伏膜蛋白基因，因此，EB病毒LMP1具備了鼻咽癌腫瘤特異抗原的基本條件。目前研究已證實(shí)LMP1具有特異的抗原決定簇，它能作為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的靶抗原觸發(fā)特異性的細(xì)胞免疫，因此，LMP1具有作為EBV相關(guān)腫瘤疫苗的理論基礎(chǔ)

5、。另外，越來越多的研究表明熱休克蛋白(HSP)能加強(qiáng)腫瘤的免疫原性，參與呈遞腫瘤抗原，激發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤特異性免疫。本實(shí)驗(yàn)的第一部分發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中HSP90β高表達(dá)。所以實(shí)驗(yàn)意圖是構(gòu)建含EB病毒LMP1和HSP90β腫瘤疫苗，即從鼻咽癌組織中克隆含有完整閱讀框架(ORF)的EB病毒潛伏膜蛋白1與熱休克蛋白90β基因，構(gòu)建其真核雙表達(dá)質(zhì)粒Pires-LMP1-HSP90β，并檢測其在體外的表達(dá)情況，為下一步進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，了解其抗腫瘤效

6、果奠定基礎(chǔ)。方法利用分子生物學(xué)技術(shù)，提取鼻咽癌總RNA,逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得LMP1和HSP90β基因片段，將二者分別與T載體相連，經(jīng)驗(yàn)證正確后進(jìn)行酶切，定向克隆入真核雙表達(dá)質(zhì)粒Pires中，測序鑒定后，用脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，采用RT-PCR和Westernblot檢測LMP1和HSP90β的體外表達(dá)情況。結(jié)果逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增的基因?yàn)槟康幕颍?與預(yù)期結(jié)果一致；目的基因已成功地連入T載體；核酸序列測定證實(shí)構(gòu)建的質(zhì)粒Pires-LMP1