擬南芥ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P2SA1在下胚軸向光彎曲中的功能分析.pdf

1、植物向光性可保證其以最佳取向獲得光源，其中藍(lán)光受體向光素(PHOT1/PHOT2)在植物向光性中起重要作用，但其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制研究以及新信號(hào)組分的確定仍亟待突破。PHOT1可調(diào)節(jié)較寬范圍藍(lán)光引起的擬南芥下胚軸向光彎曲，而PHOT2僅介導(dǎo)強(qiáng)藍(lán)光誘導(dǎo)的下胚軸向光彎曲。該現(xiàn)象既體現(xiàn)PHOT1和PHOT2功能冗余性又表現(xiàn)其作用的特異性。雖已證明向光素PHOT1可能通過(guò)橋聯(lián)蛋白NPH3、RPT2和PKS1相互作用，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素輸出輸入載體如PIN1

2、和AUX1的活性及再定位，然而具體作用機(jī)制并不清楚。遺傳分析顯示NPH3和RPT2單基因突變均可導(dǎo)致擬南芥缺失藍(lán)光誘導(dǎo)的下胚軸向光彎曲，暗示NPH3和RPT2參與調(diào)節(jié)PHOT1和PHOT2介導(dǎo)的下胚軸向光彎曲，然而RPT2僅與PHOT1相互作用，并不與PHOT2互作。PHOT2互作蛋白R(shí)CN1的發(fā)現(xiàn)有望揭開(kāi)PHOT2調(diào)節(jié)下胚軸向光彎曲的可能作用機(jī)制，然而RCN1負(fù)調(diào)節(jié)PHOT2介導(dǎo)的向光彎曲，且不與PHOT1互作。ABCB19（生長(zhǎng)素外

3、流載體）基因的發(fā)現(xiàn)，可能搭起向光素與生長(zhǎng)素之間的橋梁，遺憾的是該蛋白作為向光素的作用底物僅受PHOT1調(diào)節(jié)，不能解釋PHOT2調(diào)節(jié)下胚軸向光彎曲的機(jī)制。
　　PHOT1和PHOT2對(duì)擬南芥下胚軸向光彎曲調(diào)節(jié)的功能冗余，限制了人們對(duì)PHOT2的研究。為此，我們以擬南芥phot1突變體為材料，通過(guò)EMS誘變篩選PHOT2下游信號(hào)調(diào)節(jié)子從而避開(kāi)PHOT1基因的干擾。目前，成功篩選并克隆到2個(gè)基因，分別命名為P2SA1和P2SA2((P)

4、hototropin(2)(S)ignaling(A)ssociated)。P2SA1基因編碼一個(gè)ABC家族蛋白，P2SA2被證明是NPH3(Nonphototropic hypocotyl3)的等位基因。亞細(xì)胞定位顯示，P2SA1和P2SA2均定位于細(xì)胞質(zhì)膜。P2SA1和P2SA2基因的突變，均可導(dǎo)致擬南芥缺失強(qiáng)藍(lán)光誘導(dǎo)的下胚軸向光彎曲反應(yīng)，類(lèi)似于 phot1phot2雙突變表型。與P2SA2基因功能不同的是，P2SA1基因的突變并不

5、影響弱藍(lán)光誘導(dǎo)的擬南芥下胚軸向光彎曲。構(gòu)建P2SA1和P2SA2基因的功能回補(bǔ)載體和超表達(dá)載體獲得p2sa1 pP2SA1:P2SA1和p2sa235S∷P2SA2植株，發(fā)現(xiàn)其恢復(fù)了強(qiáng)藍(lán)光誘導(dǎo)的擬南芥下胚軸向光彎曲表型。由上可知，P2SA1可能作為PHOT1和PHOT2下游因子，特異調(diào)節(jié)PHOT1和PHOT2介導(dǎo)強(qiáng)藍(lán)光誘導(dǎo)的擬南芥下胚軸向光彎曲生長(zhǎng)，并不調(diào)節(jié)PHOT1介導(dǎo)的弱藍(lán)光誘導(dǎo)的擬南芥下胚軸向光彎曲，而P2SA2調(diào)節(jié)PHOT1和P

6、HOT2介導(dǎo)的強(qiáng)弱藍(lán)光反應(yīng)。分析P2SA1可能的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)P2SA1基因的突變也可導(dǎo)致擬南芥葉表面溫度低于野生型和phot1突變體約1℃，然而并不影響擬南芥葉綠體避光運(yùn)動(dòng)和擬南芥根負(fù)向光性生長(zhǎng)。
　　表達(dá)分析顯示，強(qiáng)藍(lán)光處理顯著誘導(dǎo)擬南芥P2SA1和PHOT2基因的表達(dá)，抑制PHOT1基因表達(dá)，且PHOT2基因的突變明顯抑制強(qiáng)藍(lán)光誘導(dǎo)的P2SA1基因表達(dá)，暗示強(qiáng)藍(lán)光誘導(dǎo)的擬南芥向光彎曲反應(yīng)主要由PHOT2調(diào)節(jié)，P2SA1可能

7、特異調(diào)節(jié)PHOT2介導(dǎo)的藍(lán)光反應(yīng)。然而P2SA1并不與藍(lán)光受體PHOT1或PHOT2互作，可與PKS1相互作用。PKS1可以與PHOT1和PHOT2發(fā)生體內(nèi)體外互作，暗示PKS1可能起到橋梁的作用搭起PHOT1和PHOT2與P2SA1之間信號(hào)傳遞。遺傳分析顯示，P2SA1、NPH3、RPT2突變的擬南芥植株，類(lèi)似于phot1phot2雙突變體表型，缺失強(qiáng)藍(lán)光誘導(dǎo)的下胚軸向光彎曲，而PKSs家族基因PKS1、PKS2和PKS4單基因突變沒(méi)

8、有表型，雙突變下胚軸向光彎曲明顯降低，三突變完全缺失向光性，類(lèi)似于phot1phot2、p2sa1-1、nph3-6以及rpt2-2突變體。有趣的是，PHOT1基因突變背景下，RPT2基因的突變并不影響下胚軸向光彎曲反應(yīng)，而P2SA1、NPH3或PHOT2基因的突變，可導(dǎo)致下胚軸喪失向光彎曲反應(yīng)。蛋白互作分析顯示，P2SA1并不與NPH3或RPT2相互作用，可以和PKS1、PKS2以及PKS4相互作用，而PKS1可以與NPH3體外互作。

9、綜上所述，藍(lán)光受體PHOT1和PHOT2感知藍(lán)光，信號(hào)傳遞于NPH3和P2 SA1，隨后可能產(chǎn)生依賴和不依賴于RPT2兩條信號(hào)傳遞途徑。正常情況下，不依賴RPT2的信號(hào)通路可被PHOT1抑制，只有當(dāng)PHOT1基因突變，才能解除對(duì)其抑制作用。PKSs家族蛋白在藍(lán)光受體PHOT1和PHOT2感受藍(lán)光刺激，向NPH3和P2SA1傳遞過(guò)程中扮演重要的角色。
　　生長(zhǎng)素的不對(duì)稱(chēng)分布決定植物的向光性，藍(lán)光照射引起的生長(zhǎng)素分布不均依賴于向光素介

10、導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。我們將含有生長(zhǎng)素報(bào)告基因的DR5rev:GFP/DR5rev:GUS野生型擬南芥與p2sa1-1突變體雜交，獲得p2sa1 DR5rev:GFP和p2sa1 DR5rev:GUS植株。暗處理下生長(zhǎng)素主要分布在擬南芥黃化苗子葉彎鉤處，胚軸面強(qiáng)藍(lán)光單側(cè)刺激可誘導(dǎo)生長(zhǎng)素向下轉(zhuǎn)移形成背光側(cè)和向光側(cè)生長(zhǎng)素的不對(duì)稱(chēng)分布，而子葉面強(qiáng)藍(lán)光單側(cè)刺激可促使生長(zhǎng)素先向背光側(cè)轉(zhuǎn)移，再向下運(yùn)輸形成生長(zhǎng)素不對(duì)稱(chēng)分布。基因P2SA1的突變，可造成擬

11、南芥缺失強(qiáng)藍(lán)光誘導(dǎo)的生長(zhǎng)素上述轉(zhuǎn)移反應(yīng)。與之相吻合的是，胚軸面和子葉面照光可導(dǎo)致擬南芥野生型下胚軸向光彎曲表現(xiàn)明顯差異，然而基因P2SA1的突變，不同側(cè)面照光擬南芥均表現(xiàn)為下胚軸向光彎曲缺失。該結(jié)果證實(shí)P2SA1調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的運(yùn)輸，介導(dǎo)擬南芥下胚軸向光彎曲反應(yīng)。蛋白互作分析顯示，P2SA1并不與生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體P1N1和AUX1互作，PKS1可以與PIN1和CAM4發(fā)生體外體內(nèi)互作。結(jié)合前期研究結(jié)果NPA（生長(zhǎng)素外流載體抑制劑）抑制強(qiáng)藍(lán)光誘

12、導(dǎo)擬南芥下胚軸胞質(zhì)Ca2+升高和向光彎曲反應(yīng)，表明PKS1可能傳遞P2SA1介導(dǎo)的藍(lán)光信號(hào)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素運(yùn)輸，調(diào)節(jié)下胚軸Ca2+變化，介導(dǎo)強(qiáng)藍(lán)光誘導(dǎo)的擬南芥下胚軸向光彎曲反應(yīng)。
　　綜上所述，我們成功篩選并克隆了兩個(gè)基因P2SA1和P2SA2，P2SA1基因編碼一個(gè)ABC家族蛋白，P2SA2被證明是NPH3的等位基因。P2SA1和P2SA2均定位于細(xì)胞質(zhì)膜，參與調(diào)節(jié)強(qiáng)藍(lán)光誘導(dǎo)的擬南芥下胚軸向光彎曲反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)P2SA1除特異調(diào)節(jié)強(qiáng)藍(lán)

13、光誘導(dǎo)的擬南芥下胚軸向光彎曲反應(yīng)外，還參與調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)，然而并不調(diào)節(jié)擬南芥葉綠體避光運(yùn)動(dòng)和根負(fù)向光性反應(yīng)。P2SA1對(duì)擬南芥下胚軸向光彎曲的調(diào)節(jié)依賴于其與PKS1互作，以接收PHOT1和PHOT2感知的強(qiáng)藍(lán)光信號(hào)，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的橫向和縱向運(yùn)輸，促使生長(zhǎng)素的不對(duì)稱(chēng)分布，進(jìn)而導(dǎo)致擬南芥下胚軸不對(duì)稱(chēng)生長(zhǎng)，表現(xiàn)向光彎曲。上述結(jié)果，將為解析藍(lán)光受體PHOT1和PHOT2下游信號(hào)調(diào)節(jié)子選擇差異，探討植物強(qiáng)藍(lán)光應(yīng)答過(guò)程中的信號(hào)整合與區(qū)分的基本機(jī)制提供新