桃蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的功能驗(yàn)證與PpSUT2蛋白表達(dá)分析.pdf

1、桃（Prunus Persica(L.)Batsch.）因其營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特在園藝產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位。桃果實(shí)的品質(zhì)受多種因素影響，如光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和積累。蔗糖作為碳水化合物的主要存在形式，在源葉合成后經(jīng)過韌皮部的運(yùn)輸?shù)竭_(dá)各庫器官，如果實(shí)中。桃果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量很大程度上取決于所含碳水化合物的種類和數(shù)量。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為碳水化合物裝載進(jìn)韌皮部，且從合成部位運(yùn)輸?shù)接行枨蠼M織部位的主要介質(zhì)，負(fù)責(zé)蔗糖的裝載、卸載和分配。通過研究蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作

2、用機(jī)制，可以幫助理解決定果實(shí)生長和品質(zhì)的蔗糖積累的過程。因此，對(duì)植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的深入探索研究是很有必要的。該試驗(yàn)在本課題組的研究基礎(chǔ)上，從桃中克隆出桃蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的3個(gè)成員PpSUT1，PpSUT2和PpSUT4，利用缺陷型酵母對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證，通過對(duì)PpSUT2進(jìn)行原核表達(dá)，制備了多克隆抗體，并對(duì)桃各組織中PpSUT2的蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，為基因的免疫細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)互作因子等研究提供了重要依據(jù)。主要作了如下幾項(xiàng)研究：
　　

3、1．桃SUTs的克隆和序列分析
　　從桃中克隆出其蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因PpSUT1（KU230443），PpSUT2（KJ152144）和PpSUT4（KU198999）分別與桃基因組序列ppa004033m，ppa003041m和ppa004620m相一致。此處得到的PpSUT2基因含有長度為1830bp的ORF，比此前克隆的PpSUT2（1782bp）多出47個(gè)堿基，編碼長度為609個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
　　2．桃SUTs

4、在酵母中的功能分析
　　通過構(gòu)建酵母表達(dá)載體，將桃的3個(gè)SUT基因在具有蔗糖吸收缺陷的酵母菌株SUSY7/ura3中進(jìn)行異源表達(dá)，PpSUT1、PpSUT2和PpSUT4在SD-蔗糖培養(yǎng)基上都表現(xiàn)出了功能的互補(bǔ)，表明這3個(gè)桃蔗糖運(yùn)蛋白基因都分別編碼一個(gè)具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的功能性蛋白。
　　3．桃PpSUT2的原核表達(dá)及抗體制備
　　根據(jù)PpSUT2基因的ORF序列，構(gòu)建pET32a-PpSUT2重組質(zhì)粒，在表達(dá)菌株大腸桿

5、菌BL21(DE3)PlysS中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，所得到融合蛋白的分子量約為84kD。以純化的PpSUT2-His蛋白為抗原進(jìn)行兔免疫，用間接ELISA對(duì)抗血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，其效價(jià)達(dá)到了1:12800，Western blot分析顯示該抗體能特異性識(shí)別PpSUT2融合蛋白，表明制備的PpSUT2多克隆抗體具有較高的檢測(cè)靈敏度和特異性。
　　4．桃PpSUT2的蛋白組織特異性表達(dá)
　　提取桃不同組織的總蛋白，進(jìn)行Wester