檉柳冷適應蛋白（CAP）基因的功能驗證.pdf

1、本研究將從極度抗旱、耐鹽、抗寒木本植物檉柳(Tamarix androssowii)中克隆得到的冷適應蛋白(cold acclimation protein，cap)基因，構建到酵母表達載體pYES2和植物表達載體pROK Ⅱ中，進一步在真核細胞中驗證cap基因的功能。 主要實驗結果如下： (1)將cap基因與酵母表達載體pYES2連接，獲得了pYES2-cap重組質粒。將 pYES2-cap轉化酵母菌INVScl。隨機

2、挑選10個INVScl(pYES2-cap)單菌落，經PCR檢測證明cap基因已構建到pYES2載體上。對1NVScl(pYES2-cap)和INVScl(pYES2)菌株進行誘導，研究外源基因在酵母中的的表達情況。Northern雜交結果表明，cap基因已經在重組酵母INVScl(pYES2-cap)中表達。 (2)重組酵母INVScl(pYES2-cap)的NaCI、Na<,2>CO<,3>、NaHCO<,3>、干旱、紫外線

3、等脅迫，實驗表明，INVScl(pYES2-cap)酵母的抗逆性明顯高于對照INVScl(pYES2)菌株，說明在酵母受到逆境脅迫時，cap基因表達的冷適應蛋白對酵母細胞起到了保護作用，同時也證實了檉柳的cap基因具有提高真核生物抗逆性的功能。 (3)對山新楊進行遺傳轉化，獲得卡那霉素抗性芽，從中隨機選出8個株系，進行PCR和Southern斑點雜交，證明cap基因已整合到山新楊基因組中：進一步對8個株系進行RT-PCR和Nor

4、thern雜交檢測，結果表明外源基因能夠在轉錄水平上表達。 (4)分別對7個轉基因山新楊移栽苗進行了低溫脅迫試驗，測定并分析了脅迫后葉綠素含量、相對電導率、丙二醛(MDA)含量，結果顯示，隨著低溫脅迫時間的加劇，非轉基因山新楊葉綠素含量明顯下降，脅迫1 d后轉基因山新楊葉綠素含量平均高于對照20.49％；在冷脅迫下，轉基因山新楊相對電導率平均值低于對照山新楊的33.88％；對照山新楊MDA含量為34.18 μmo L.g<'-1

5、>，而轉基因山新楊MDA含量大多在18.86～33.14 μmoL.g<'-1>左右，低于對照山新楊，上述指標均說明cap基因的導入提高了山新楊的抗低溫能力。 (5)分別對8個轉基因株系進行了NaCl脅迫，分析逆境脅迫條件下轉基因山新楊與非轉基因對照山新楊的丙二醛(MDA)含量、相對電導率等指標的變化。結果表明，NaCl脅迫處理后，各株系的相對電導率、MDA含量都逐漸增大，各轉基因株系相對電導率平均值低于對照山新楊的15.3