野生毛葡萄質(zhì)膜水通道蛋白基因的克隆與功能驗證.pdf

1、原產(chǎn)于貴州喀斯特地區(qū)的野生毛葡萄（Vitis quinquangularis）具有極強的抗旱性。水通道蛋白在介導(dǎo)植物體水分的運輸、維持水分平衡和應(yīng)對各種逆境脅迫中起著重要的作用。為了探究喀斯特地區(qū)野生葡萄質(zhì)膜水通道蛋白基因的結(jié)構(gòu)特征，及其在干旱脅迫中的作用，以極抗旱的野生毛葡萄‘花溪-9’為試材，不抗旱歐亞種葡萄（V.vinifera）‘紅地球’為對照，應(yīng)用RT-PCR和 RACE技術(shù)克隆毛葡萄PIP類水通道蛋白基因的cDNA全長序列，

2、并就基因的結(jié)構(gòu)特征、組織表達模式、PEG模擬干旱脅迫對其表達的影響進行分析，并結(jié)合水分相關(guān)生理指標(biāo)探究其抗旱機理，構(gòu)建基因表達載體，對其進行功能驗證。主要取得以下研究結(jié)果：
　　1.利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆并獲得9個野生毛葡萄質(zhì)膜水通道蛋白基因（VhPIP）的全長cDNA序列。9個PIP基因的全長分別為：1087、1063、1089、970、867、1054、1111、1156、860 bp，分別包含858、861、86

3、4、861、858、852、840、864、855 bp的完整開放閱讀框。分別命名為：VhPIP1;1、VhPIP1;2、VhPIP1;3、VhPIP1;4、VhPIP1;5、VhPIP2;1、VhPIP2;2、VhPIP2;3、VhPIP2;4，GeneBank登錄號分別為：KM026528、KP164979、KP164980、KP729192、KP765449、KP164981、KP164982、KP729193和KP729194。

4、
　　2.經(jīng)生物信息學(xué)分析，9個VhPIPs氨基酸序列均具有 MIP家族信號序列SGGHINPAVT以及植物質(zhì)膜水通道蛋白（PIPs）的特征信號序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN，分別編碼286、286、287、286、285、283、279、287、284個氨基酸，相對分子質(zhì)量在29.6 kD~30.7kD之間，理論等電點（pI）在7.7~8.9之間，不穩(wěn)定系數(shù)在26.14~34.0

5、6之間，均為穩(wěn)定性蛋白。VhPIPs蛋白的親水平均數(shù)均在0.367~0.569之間，為親水性蛋白，且無信號肽。對擬南芥、野生毛葡萄、歐洲葡萄和冬葡萄×沙地葡萄雜交種的35個PIPs類氨基酸序列進行同源序列比對，結(jié)果表明這些氨基酸的功能區(qū)域高度保守，同源性在77.8％以上。對這35個PIPs氨基酸序列進行聚類分析表明，35個PIPs被分為兩類，PIP1s占據(jù)一個分支，PIP2s占據(jù)另一個分支。
　　3.利用熒光定量PCR技術(shù)對9個P

6、IP基因的組織表達模式進行分析，結(jié)果表明9個PI P基因在葡萄的根、莖和葉中均有表達，其中抗旱性極強的‘花溪-9’中的VhPI P1;1、VhPIP1;2、VhPIP1;4、VhPIP2;1、VhPIP2;2和VhPIP2;4在地下部的表達量最多，VhPIP1;5和Vh PIP2;3在葉中的表達量最多，VhPI P1;3在根、莖和葉中的表達量無顯著性差異。而在抗旱性不強的歐亞種‘紅地球’中VvPIP1;1、VvPIP1;4和VvPIP2

7、;3在根中的表達量較高，VvPIP1;2、VvPIP1;3、VvPIP1;5和VvPIP2;4在地上部的表達量較高，VvPIP2;1和Vv PI P2;2在其根、莖和葉中的表達量無顯著性差異。
　　4.對9個PIP基因的干旱脅迫表達模式進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的PIP基因在不同葡萄品種（單株）的不同組織中的表達模式有一定的差異。在不同品種（單株）的不同組織中，這9個PIP基因的干旱表達模式主要分為3種：表達量沒有發(fā)生顯著性變化，即‘

8、花溪-9’和‘紅地球’根、莖和葉中的PIP1;2、PIP1;4、PIP1;5和PIP2;3，‘紅地球’根中的VvPIP1;3；表達量呈先上升后下降的變化趨勢，即‘花溪-9’根中的VhPIP1;1、VhPIP2;1、VhPIP2;2和 VhPIP2;4，莖中的 VhPIP1;1、VhPIP2;1和 VhPIP2;2，葉中VhPIP2;2，‘紅地球’根、莖和葉中的VvPIP1;1、VvPIP2;1和VvPIP2;2，葉中的VvPIP2;4；

9、表達量呈下降趨勢，即‘花溪-9’根、莖和葉中的Vh PI P1;3，莖和葉的Vh PI P2;4，葉中VhPIP2;1，‘紅地球’莖中的VvPIP1;3和VvPIP2;4，葉中的VvPIP1;3。綜上，PIP1;1、PIP1;3、PIP2;1、PIP2;2、PIP2;4表達量的變化有顯著性差異。
　　5.氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、葉片水勢、葉片相對含水量和根、莖和葉的質(zhì)膜相對透性在不同抗旱性的葡萄單株（品種）中的變化有顯著性差異。在干旱

10、脅迫下，氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、葉水勢和葉片相對含水量隨著時間的延長逐漸降低，根、莖和葉的質(zhì)膜相對透性逐漸增大，細胞膜的穩(wěn)定性逐漸降低。將PIP1;1、PIP1;3、PIP2;1、PIP2;2、PIP2;4在干旱脅迫下的表達模式與各水分相關(guān)生理指標(biāo)進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、葉片水勢和葉片相對含水量與基因的表達量呈正相關(guān)，質(zhì)膜透性與基因的表達量呈負相關(guān)。且 VhPIP2;1、VhPIP2;2、VhPIP2;4與‘花溪-9’

11、的各水分生理指標(biāo)相關(guān)性較大，結(jié)合最大相關(guān)系數(shù)（r2）可知，VhPIP2;1與各水分相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系最大，選擇其進行功能驗證。
　　6.成功構(gòu)建了植物表達載體pBI121-35S-VhPIP2;1，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)與花絮浸漬法相結(jié)合將VhPIP2;1成功導(dǎo)入擬南芥。對T4代轉(zhuǎn)基因植株進行PEG-6000模擬干旱脅迫處理，檢測轉(zhuǎn)基因植株對干旱脅迫的耐性。結(jié)果表明轉(zhuǎn)VhPIP2;1基因的植株對干旱脅迫的耐性均高于野生型植株，轉(zhuǎn)基因植株的幼苗