植物栓塞修復(fù)機(jī)制與質(zhì)膜內(nèi)在水通道蛋白基因的克隆、表達(dá)和轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、水分是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的五大關(guān)鍵因子之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需要消耗大量的水分。植物體內(nèi)水分的長(zhǎng)距離運(yùn)輸是通過(guò)木質(zhì)部導(dǎo)管或管胞系統(tǒng)進(jìn)行的，所以木質(zhì)部栓塞會(huì)降低或阻斷水分長(zhǎng)距離運(yùn)輸。細(xì)胞膜上的水通道蛋白決定了水分的跨細(xì)胞移動(dòng)，根系吸收的水分絕大部分是通過(guò)水通道蛋白進(jìn)行，經(jīng)過(guò)具有凱氏帶的內(nèi)皮層進(jìn)入中柱的導(dǎo)管或管胞，最終運(yùn)輸?shù)角o、葉。在木質(zhì)部韌皮薄壁細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量的水通道蛋白，它們不參與長(zhǎng)距離水分運(yùn)輸。然而，它們是否參與木質(zhì)部栓塞修復(fù)？迄今

2、為止，其仍鮮有報(bào)道；另外，關(guān)于水通道蛋白在整個(gè)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程所扮演的角色也值得進(jìn)一步探究。
　　本研究以84K楊（Poplus alba× Poplus. glandulosa）為試材，對(duì)其木質(zhì)部栓塞修復(fù)機(jī)制進(jìn)行初步探討。并利用基因工程技術(shù)，成功克隆了PtPIP1;1，PtPIP1;3，PtPIP1;5，PtPIP2;1，PtPIP2;2，PtPIP2;3，PtPIP2;4，PtPIP2;7和PtPIP2;8這9個(gè)PtPIPs基

3、因的cDNA全長(zhǎng)，構(gòu)建了其中5個(gè)水通道蛋白基因的植物表達(dá)載體，獲得84K楊和擬南芥的轉(zhuǎn)基因植株，旨在探討水通道蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程所起的作用。主要研究結(jié)果如下：
　　1.84K楊木質(zhì)部栓塞的修復(fù)是從上方和下方兩個(gè)方向同時(shí)進(jìn)行，其木質(zhì)部栓塞的修復(fù)是根系壓力和導(dǎo)管周邊薄壁細(xì)胞中的水通道蛋白共同作用的結(jié)果。
　　2.84K楊的栓塞和氣孔導(dǎo)度表現(xiàn)出“疲勞”反應(yīng)，受過(guò)脅迫的苗木對(duì)溫度和濕度更為敏感，其木質(zhì)部的栓塞脆弱性更大、氣孔更為

4、敏感。
　　3.在干旱環(huán)境下，84K楊苗木具有較好的自我保護(hù)機(jī)制。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，84K楊可以有效保護(hù)光合器官免受非可逆性損傷，最大光量子效率PSII（Fv/Fm）一直保持在0.8左右，植物處于健康生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　4.應(yīng)用geNorm、NormFinder和BestKeeper3個(gè)軟件統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)Real-timePCR技術(shù)，篩選得到干旱-復(fù)水處理過(guò)程中84K楊木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中表達(dá)量穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因：EIF-5A、E

5、F4-L、UBQ和84K楊根系、木質(zhì)部薄壁細(xì)胞、葉片三個(gè)組織中表達(dá)量穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因：EIF-5A、CYP、UBQ。
　　5.應(yīng)用各種生物信息學(xué)工具對(duì)PtPIPs基本物理性質(zhì)、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、功能及其功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明PtPIP1;1，PtPIP1;3，PtPIP2;3，PtPIP2;7和PtPIP2;8基因序列與MIP保守區(qū)序列一致，且含有植物質(zhì)膜內(nèi)在蛋白C環(huán)和E環(huán)的特征信號(hào)序列，具有與孔道形成有關(guān)的高度保守

6、單元；其編碼的蛋白質(zhì)為穩(wěn)定的疏水性蛋白，跨膜結(jié)構(gòu)域具有典型5個(gè)短環(huán)相連的6個(gè)親水的跨膜區(qū)且分布基本對(duì)稱。值得指出的是PtPIP2;7和PtPIP2;8不符合N-末端和C-末端位于細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的特點(diǎn)；PtPIP1;3含有1個(gè)微體C-末端定位信號(hào)，PtPIP2;8（285-287）含有1個(gè)糖基化位點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)特異性可能意味其功能的特異性。因此，我們認(rèn)為PtPIP1;3、PtPIP2;7和PtPIP2;8具有更大的研究?jī)r(jià)值。
　　6.通過(guò)R

7、eal-time PCR技術(shù)，得到如下相對(duì)表達(dá)量排序結(jié)果：84K楊和毛白楊的木質(zhì)部薄壁細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因（PtPIPs）排序分別為PIP1;3> PIP2;1> PIP2;3>PIP1;5> PIP2;4> PIP2;2> PIP1;1> PIP1;2和 PtPIP1;3> PtPIP2;3> PtPIP2;2>PtPIP2;1> PtPIP1;1> PtPIP2;7> PtPIP2;4> PtPIP1;5；84K楊的根系排序?yàn)镻IP

8、1;3>PIP1;1>PIP2;2=PIP2;1>PIP2;4>PIP2;7=PIP2;8>PIP1;5=PIP1;2；84K楊葉片和葉柄排序基本一致：PIP1;3> PIP2;1> PIP2;4> PIP2;3> PIP2;2> PIP1;5> PIP1;1>PIP1;2。根據(jù)研究目的選取 PtPIP1;1、PtPIP1;3、PtPIP2;3、PtPIP2;7和 PtPIP2;8進(jìn)行表達(dá)載體構(gòu)建。
　　7.以pBI121和pBI

9、RNAi植物表達(dá)載體為中間載體，成功構(gòu)建了PtPIP1;1、PtPIP1;3、PtPIP2;3、PtPIP2;7和PtPIP2;8這5個(gè)基因的13個(gè)植物表達(dá)載體（5個(gè)超表達(dá)植物表達(dá)載體、4個(gè)RNAi抑制植物表達(dá)載體和4個(gè)特異啟動(dòng)子植物表達(dá)載體）。
　　8.獲得PtPIP1;1、PtPIP2;3和PtPIP2;83個(gè)基因的異源超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥。與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)PtPIP1;1基因的擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育加快，氣孔密度增大；葉片相對(duì)含