陰道毛滴蟲鐵氧還蛋白基因的克隆與表達.pdf

1、四川大學碩士學位論文陰道毛滴蟲鐵氧還蛋白基因的克隆與表達姓名：謝輝申請學位級別：碩士專業(yè)：病原生物學指導教師：王雅靜20050420叫川大學碩士學位論文Chelex—100方法提取基因組DNA，根據(jù)文獻設計合成引物，用PCR法擴增Fd基因，克隆kpⅦ)18T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌JMl09感受態(tài)細胞中，經(jīng)PCR及限制性酶切鑒定，測序并進行序列分析，分析該基因四『lf分離株和國際標準株之闖的差異。結(jié)果：我們成功地從四川分離株中擴增和克隆出

2、長度為306bp的Fd基因，與國際標準抹比較，同緣性為99％，這方面存瑩工作為鼗國滴蟲病的防治提供了科學依據(jù)。第二部分：目的：Fd基因的原核表達和真核表達質(zhì)粒的構建。方法：首先犍從臨床分離的陰道毛流蟲傳代數(shù)次后，調(diào)整蟲量。超聲粉碎，制備可溶性全蟲抗原，應用Bardford法檢測抗原濃度。約300pg抗原與等量佐劑混合多點注射免疫家兔，制各抗陰道毛滴蟲多克隆抗體?？寡逵肊LISA法檢測效價。測序正確的重組質(zhì)粒p_IID18TFd經(jīng)雙酶切

3、后，亞克隆入原核表達質(zhì)粒pucl9，轉(zhuǎn)化到大腸埃希氏菌的重組質(zhì)粒pUCl9一Fd經(jīng)Im誘導，SDSPAGB和Westernblot鑒定蛋白質(zhì)表達情況。本研究同I橢Johnson教授惠贈原核表達重組質(zhì)粒pET3CFd轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中，用IFFG誘導表達。因為陰道毛滴蟲是屜原始的真核細胞，我們構建了Fd基因真核表達重組質(zhì)粒pcDNA31(十)一Fd，為下一步研究打下基礎。結(jié)果：制備的可溶性全蟲抗原，濃度是0449／L，免疫家兔后得到多

4、克隆抗體效價為I：8000以上，可用于westernblot的一抗以及其住的免疫反應。構建l簦JpUCl9Fd重組質(zhì)粒測序鑒定正確，經(jīng)IPTG誘導，SDSPAGE檢測在14(d處有新增蛋自條帶，Westernblot分析有陽性雜交信號，說明克隆寄勺Fd基因能夠表達，我們又用同樣方法表達了重組質(zhì)粒pET3CFd，為研究該蛋白質(zhì)的結(jié)構功能創(chuàng)造了努彳牛。我們成功地亞克隆出真援表達重組重組質(zhì)粒pcDNA31()一Fd，為開展下～步研究打下基礎。