陰道毛滴蟲Tvmar1基因多態(tài)性及AP33基因序列分析.pdf

1、陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis,Tv)是一種寄生于人體泌尿生殖道的病原體,引起的疾病稱為陰道毛滴蟲病,是最普遍的非病毒性性傳播疾病(sexually transmitteddisease,STD)之一,占全世界每年新發(fā)STD患者的50％以上。該病表現(xiàn)出從無癥狀到嚴重的滴蟲性陰道炎等泌尿生殖道癥狀,其發(fā)病與蟲株毒力和宿主生理狀態(tài)有密切關(guān)系。陰道毛滴蟲除引起滴蟲性陰道炎外,還會增加感染如艾滋病和乙型肝炎等其他性傳播疾

2、病的機會,因而對人體危害很大。人型支原體(Mycoplasma hominis,MH)是廣泛寄生于人體的病原體,也是能獨立生存的最小微生物,可引起多種癥狀,如自發(fā)性流產(chǎn)、產(chǎn)后高熱、子宮內(nèi)膜移位和輸卵管炎等。陰道毛滴蟲攜同人型支原體感染宿主,更加增加發(fā)病機制的復(fù)雜性。由于人型支原體與陰道毛滴蟲兩種均營寄生生活的病原體共生關(guān)系的發(fā)現(xiàn),重新評估它們在流行病學(xué)、遺傳和生理方面的相互影響很有必要。
　　本研究利用人型支原體的特異引物,通過聚

3、合酶鏈式反應(yīng)(Polymerse chain reaction,PCR)對41株陰道毛滴蟲樣品進行檢測,了解河南地區(qū)陰道毛滴蟲與人型支原體的共生情況,為滴蟲病的臨床治療提供新的理論依據(jù)。同時,研究陰道毛滴蟲與體內(nèi)共生的人型支原體之間的相互關(guān)系,分析共生關(guān)系對毛滴蟲基因多態(tài)性和分子進化的影響。運用可移動因子PCR(MGE-PCR),對從河南各地分離到的陰道毛滴蟲蟲株進行基因多態(tài)性分析,明確他們之間的親緣關(guān)系,根據(jù)我們收集的陰道毛滴蟲的有關(guān)

4、資料,包括滴蟲病患者的臨床表現(xiàn)、地理來源、人型支原體的共生,分析了陰道毛滴蟲遺傳多態(tài)性與這些因素的相關(guān)性,為在我省開展毛滴蟲分子流行病學(xué)提供有價值的分子數(shù)據(jù)。
　　深入研究陰道毛滴蟲和人型支原體的共生關(guān)系將有助于我們加深物種共進化的認識,為共進化研究提供新的理論依據(jù)。關(guān)于毛滴蟲的致病機制目前還不完全清楚,滴蟲感染首先從黏附于宿主陰道上皮細胞開始,此步至關(guān)重要,這一功能需借助滴蟲表面的黏附蛋白33(Adhesion Protein3

5、3,AP33)完成。AP33是細胞膜上一種非常重要的毒力因子,以受體—配體方式介導(dǎo)蟲體對宿主泌尿生殖道上皮細胞的黏附。AP33基因編碼滴蟲表面黏附蛋白AP33。
　　本文采用PCR擴增有癥狀株和帶蟲株及支原體共生株和無支原體共生株AP33基因,并進行序列分析,從基因水平上對陰道毛滴蟲的致病機制進行有益的探討。
　　材料與方法:
　　本研究所用的41株陰道毛滴蟲來至河南不同地區(qū),由鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科或婦產(chǎn)科提供,從病

6、人的陰道分泌物或尿液獲得,且標本均來自女性患者。用肝浸湯培養(yǎng),用酚-氯仿法提取其DNA。用PCR方法檢測41株陰道毛滴蟲蟲株人型支原體的共生情況。利用MGE-PCR技術(shù),分析30株陰道毛滴蟲的Tvmar1基因的長度和位點多態(tài)性,利用臨位相連法(neighbour-joining,NJ)借助MEGA4.0分析軟件,以MGE-PCR擴增結(jié)果繪制30株陰道毛滴蟲的聚類圖。最后用PCR技術(shù)對41株陰道毛滴蟲AP33基因進行擴增,選取8株毛滴蟲包

7、括臨床癥狀不同、不同地區(qū)及支原體共生的陽性和陰性株,送上海生物公司進行測序。
　　結(jié)果:
　　1.本研究通過對41株毛滴蟲經(jīng)PCR檢測結(jié)果顯示,34株毛滴蟲擴增出人型支原體特異的334bp片段,感染率為82.9％。7株未能擴增出334bp的特異片段,人型支原體為陰性。
　　2.本研究通過對30株陰道毛滴蟲蟲株進行MGE-PCR分析,得出其平均相似系數(shù)為31.95％,平均遺傳距離為68.05％,遺傳距離GD變化較大,從0

8、-100％。根據(jù)臨位相連法,借助MEGA4.0分析軟件構(gòu)建樹狀聚類圖,發(fā)現(xiàn)(Tv16、Tv41);(Tv16、Tv37);(Tv37、Tv41)三組遺傳關(guān)系最為密切,遺傳距離為0。說明蟲株間的基因差異明顯。
　　3.陰道毛滴蟲AP33基因的擴增結(jié)果顯示,41個蟲株均可擴增出DNA片段為930bp的特異產(chǎn)物。測序結(jié)果應(yīng)用DNASTAR軟件比對,發(fā)現(xiàn)8株陰道毛滴蟲的AP33基因序列不完全相同,但與Genbank中的AP33基因序列(U

9、87098)進行分析比較,發(fā)現(xiàn)堿基突變位點較多,各蟲株間堿基序列的相似性高達96.8％-99.3％,而各蟲株序列間差異性較低,僅0.7％-3.2％。同時發(fā)現(xiàn)支原體的存在對AP33基因有一定的影響,與地區(qū)差異關(guān)系不大。
　　結(jié)論:
　　1.河南不同地區(qū)臨床分離的陰道毛滴蟲與人型支原體的共生具有普遍性。其感染率為82.9％。
　　2.Tvmar1基因長度未存在明顯的多態(tài)性;Tvmar1基因位點存在明顯的多態(tài)性。位點多態(tài)性和