檉柳ThDREB和TheIF1A基因抗逆功能研究.pdf

1、在植物基因工程育種中,與導(dǎo)入一個(gè)功能基因相比,導(dǎo)入一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控基因的改良效果更好。而基因的表達(dá)調(diào)控是在多級水平上參加的復(fù)雜事件,其中轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)的最有效的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié),翻譯以及翻譯后加工是基因表達(dá)的基本控制點(diǎn)。因此本研究以剛毛檉柳(Tamarix hispida)的轉(zhuǎn)錄因子ThDREB和翻譯起始因子TheIF1A兩個(gè)基因?yàn)檠芯繉ο?對基因的表達(dá)和功能進(jìn)行了初步研究,以期為抗逆基因工程育種提供理論依據(jù)和基因材料。主要研究結(jié)論如下:

2、r>　　 (1)利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù),對不同脅迫條件下ThDREB和TheIF1A基因在檉柳中的時(shí)序表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,ThDREB和TheIF1A基因均能夠?qū)aCl、PEG、NaHCO3以及CdCl2脅迫做出應(yīng)答反應(yīng),并且在不同脅迫條件下基因的表達(dá)模式各不相同,具有一定的組織器官表達(dá)特異性。
　　 (2)采用基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù),分別將ThDREB-GFP和 ThelF1A-GFP融合蛋白轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞使其

3、瞬時(shí)表達(dá),結(jié)果均在細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光,表明 ThDREB和TheIF1A蛋白的表達(dá)均定位于細(xì)胞核中。
　　 (3)將ThDREB和TheIF1A分別構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES2中,重組質(zhì)粒pYES2-ThDREB和pYES2-TheIF1A轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScl,比較重組和非重組酵母在鹽(NaCl、KCl和MgCl2)、重金屬(ZnCl2、CuSO4和CdCl2)、氧化(H2O2)、滲透(山梨醇)、堿(Na2CO3)、冷(-2

4、0℃)和熱(53℃)脅迫下的生長狀況,驗(yàn)證這ThDREB和TheIF1A基因?qū)Σ煌巧锩{迫的抵抗性。結(jié)果表明ThDREB和TheIF1A基因?qū)Π}、鹽堿、干旱、過氧化物、重金屬、冷和熱在內(nèi)的多種非生物脅迫均具有良好的抵抗能力。
　　 (4)將ThDREB和TheIF1A分別構(gòu)建到植物表達(dá)載體pROKⅡ質(zhì)粒上,采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化,分別獲得16和20株卡那霉素抗性芽,PCR檢測表明基因均整合到煙草基因組中。對

5、各轉(zhuǎn)基因煙草子代分別進(jìn)行鹽(0,100,150mmol/LNaCl)、旱(0,350mmol/L Mannitol)脅迫處理,比較各株系的發(fā)芽率和鮮重,從而分析轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽抗旱能力。
　　 結(jié)果表明在不同濃度NaCl脅迫下,轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)芽率均高于非轉(zhuǎn)基因株系,并且隨著NaCl濃度的增加,非轉(zhuǎn)基因煙草的發(fā)芽率明顯受到抑制,而轉(zhuǎn)基因株系發(fā)芽率抑制相對較弱,具有較強(qiáng)的耐鹽特性；長期鹽(250mmol/L NaCl)、旱(0,15

6、0,250,350mml/L Mannitol)脅迫處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系的鮮重、根長和地上部分高均優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因株系。在干旱脅迫/滲透脅迫(Mannitol)條件下,轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)芽率和鮮重均明顯高于非轉(zhuǎn)基因株系,隨著Mannitol濃度的增加,非轉(zhuǎn)基因株系生長明顯受到抑制,而轉(zhuǎn)基因煙草鮮重、根長和地上部分高的增加顯著高于對照,其中轉(zhuǎn)基因株系D-15和1A-3耐鹽抗旱性表現(xiàn)最為突出。
　　 以上結(jié)果表明ThDREB和TheI

7、F1A基因均能在不同程度提高植物對鹽、旱的耐受能力。
　　 (5)利用基因組步移技術(shù),克隆得到長度為1352bp的TheIF1A啟動子PTheIF1A。序列分析表明,該啟動子區(qū)域包含多種與逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,如HSE、MBS、TGACG—motif、TC-rich repeats和W-box等。將啟動子PTheIF1A構(gòu)建到pCAMBIA1301中,驅(qū)動GUS基因表達(dá)。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草,染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)