小麥TaNAC29和TaNAC2D基因克隆及抗逆功能研究.pdf

1、植物經(jīng)常受到干旱、高鹽以及極端溫度等各種不利環(huán)境因素的影響，對其生長發(fā)育產(chǎn)生重大負(fù)面效應(yīng)。當(dāng)植物處于這些不利環(huán)境條件時，其體內(nèi)許多相關(guān)基因會誘導(dǎo)表達(dá)。其中，轉(zhuǎn)錄因子就是這些重要基因中的一類。在轉(zhuǎn)錄因子家族中，NAC（NAM，ATAF與CUC）轉(zhuǎn)錄因子通過與其相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合，作為分子開關(guān)調(diào)控基因的時空表達(dá)。近年來，關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長發(fā)育、衰老以及響應(yīng)非生物脅迫等方面的研究越來越多，但小麥作物中有關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能

2、分析還鮮有報道。本文以小麥NAC轉(zhuǎn)錄因子為研究對象，首先從普通小麥中國春基因組中鑒定、分離出10個TaNAC基因，在此基礎(chǔ)上重點研究了TaNAC29和TaNAC2D兩個基因的生物學(xué)功能。主要的研究結(jié)果如下：
　　1）通過小麥EST數(shù)據(jù)庫搜索，我們成功拼接并克隆得到了10個小麥TaNAC基因，其中有9個為新鑒定的TaNAC基因。
　　2）序列比對表明，新基因TaNAC29定位于小麥2BS染色體。TaNAC29蛋白定位于小麥原生

3、質(zhì)體的細(xì)胞核，并通過酵母單雜交試驗證明其具有轉(zhuǎn)錄激活活性，酵母實驗還揭示了L基序?qū)aNAC29的轉(zhuǎn)錄激活活性是必需的。TaNAC29基因在小麥葉片中具有較高的表達(dá)水平，在小麥成熟衰老葉片中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在幼嫩綠色葉片中的表達(dá)水平，這一結(jié)果暗示TaNAC29基因可能參與小麥葉片的衰老進(jìn)程。實時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，小麥幼苗經(jīng)過高鹽、PEG6000、過氧化氫以及ABA處理后，TaNAC29基因在小麥葉片和根中的表達(dá)水平均明顯增加。為

4、了檢驗TaNAC29基因的生物學(xué)功能，我們獲得了TaNAC29過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。轉(zhuǎn)基因植物發(fā)芽和根長實驗證明了過表達(dá)TaNAC29能顯著提高對高鹽和脫水脅迫的耐受性，轉(zhuǎn)基因擬南芥還表現(xiàn)出對外源ABA過敏性響應(yīng)。TaNAC29過表達(dá)植株在營養(yǎng)生長和生殖生長期，均增加了對高鹽和干旱脅迫的耐受性，并且在生殖生長期間，還表現(xiàn)出延遲抽薹和開花現(xiàn)象。此外，在高鹽或脫水脅迫條件下，TaNAC29過表達(dá)植物可以積累更少的丙二醛和過氧化氫，具有更高的

5、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性。在黑暗條件下，TaNAC29轉(zhuǎn)基因小麥初步的實驗結(jié)果亦顯出離體葉片衰老加速的現(xiàn)象，表明TaNAC29基因正調(diào)控植物葉片的衰老。
　　3）基因TaNAC2D定位于小麥的5BL染色體上。轉(zhuǎn)錄激活實驗也證明TaNAC2D是一個轉(zhuǎn)錄活化因子，其單獨的羧基端（173-327）足以激活報告基因的表達(dá)。TaNAC2D也定位于小麥原生質(zhì)體細(xì)胞核中，符合轉(zhuǎn)錄因子的特征。TaNAC2D基因在小麥葉片中的表達(dá)水平高于其它

6、器官?；虮磉_(dá)模式分析表明，小麥幼苗在高鹽、脫水、ABA以及過氧化氫處理下，TaNAC2D基因都上調(diào)表達(dá)。為了明確TaNAC2D基因的生物學(xué)功能，我們獲得了TaNAC2D基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。在土壤中生長了35天的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系分別經(jīng)過高鹽和干旱脅迫處理后，TaNAC2D過表達(dá)植株比野生型植株表現(xiàn)出更高的敏感性響應(yīng)，但在種子萌發(fā)以及萌發(fā)后生長期間，相對于野生型植物，TaNAC2D過表達(dá)植物則提高了對高鹽、脫水以及氧化脅迫的耐受性。

7、為了進(jìn)一步理解這兩種不同的表型反應(yīng)，我們分析了相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)水平。在1/2 MS培養(yǎng)基上生長了14天的擬南芥幼苗浸泡在高鹽中6 h或脫水處理1 h，相對于野生型植物，TaNAC2D過表達(dá)植物中的NCED3、RD29A和RD29B基因的轉(zhuǎn)錄水平都顯著上調(diào)，然而，在土壤中生長了35天的植物浸泡在高鹽中6 h或脫水處理3 h，相對于野生型植物，這些標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)基因植物中幾乎都下調(diào)表達(dá)。
　　綜合上所述，TaNAC29過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物