水稻中激素和肌醇磷酸代謝相關(guān)基因的抗逆功能研究.pdf

1、干旱、高鹽、極端溫度等非生物逆境是植物生長發(fā)育過程中最重要的限制因子，植物對非生物逆境的響應(yīng)伴隨著對生長發(fā)育過程很多基因的調(diào)。水稻是世界最重要的糧食作物之一，維持正常的發(fā)育過程和產(chǎn)量需要很好的氣候條件，然而缺乏的淡水資源和極端的溫度經(jīng)常發(fā)生，嚴重影響水稻的產(chǎn)量。因此提高作物對非生物逆境的抗性是我們亟待解決的事情，在過去的幾十年中，人們努力尋找可以提高作物抗逆性的基因，很多研究發(fā)現(xiàn)超量表達或抑制表達一些基因可以顯著提高作物的抗逆性。

2、>　　 Abscisic acid(ABA)，乙烯，生長素和肌醇三磷酸IP3通過復(fù)雜的信號傳導(dǎo)和代謝過程，調(diào)控植物生長發(fā)育和應(yīng)答環(huán)境信號。然而這些信號分子與非生物逆境之間的關(guān)系還有很多未知的地方。為了在水稻中鑒定一些和非生物逆境相關(guān)的基因，我們篩選了水稻T-DNA插入突變體及超表達一些非生物逆境誘導(dǎo)的候選基因。我們對兩個個干旱敏感的突變體(dsm2，dsm3)和一個抗旱突變體(osetol1)的基因進行了深入功能分析。此外，我們還基于

3、OsGH3-2超表達水稻干旱敏感表型分析了該基因的抗逆功能。主要結(jié)果如下:
　　 干旱敏感的突變體dsm2由于T-DNA插入失活的是一個編碼β-胡蘿卜素羥化酶的基因，該基因的轉(zhuǎn)錄水平在微管組織及孕穗期葉片中表達量較高，且受干旱、高鹽及紫外線處理誘導(dǎo)上升表達，該基因編碼一個葉綠體蛋白催化由β-胡蘿卜素生成玉米黃質(zhì)的反應(yīng)，此過程也是ABA合成途徑中的重要步驟之一。在干旱脅迫條件下，突變體對干旱非常敏感主要表現(xiàn)在失水速率快，相對含水量

4、較低，光合速率、花粉育性、結(jié)實率、生物量均顯著低于對照，而丙二醛含量及氣孔開放率顯著高于對照，是由于突變體在干旱脅迫條件下，ABA含量顯著下降。此外突變體對氧化脅迫處理如紫外線(UV)及甲基紫精(MV)表現(xiàn)敏感，葉綠體熒光參數(shù)測定表明突變體光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)及非光化學猝滅(NPQ)能力較野生型對照顯著降低，表明在突變體中光合系統(tǒng)Ⅱ中極易出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象，高效液相色譜結(jié)果表明突變體中玉米黃質(zhì)含量下降致使參與高光保護及消除活性氧的葉黃

5、質(zhì)循環(huán)處于較低的水平，導(dǎo)致dsm2突變體對氧化脅迫敏感的表型。DSM2超量表達的水稻植株表現(xiàn)出對干旱及氧化脅迫較強的抵抗能力，以及較強的葉黃質(zhì)循環(huán)水平和光保護能力，主要是由于較高的葉黃質(zhì)循環(huán)水平。此外突變體和超表達植株在干旱脅迫前后一些ABA合成和信號傳導(dǎo)相關(guān)基因，及氧化脅迫相關(guān)基因表達量有顯著差異。DSM2同源序列比對發(fā)現(xiàn)水稻基因組中共有三個同源基因，但由于該家族基因在進化過程中啟動子區(qū)段出現(xiàn)了不同的選擇，DSM2基因啟動子區(qū)域富集逆

6、境相關(guān)的順式作用元件，其受干旱和UV誘導(dǎo)最強，與另外兩個同源基因表現(xiàn)出不同的逆境誘導(dǎo)表達模式和組織特異性表達模式。
　　 干旱敏感的突變體dsm3由于T-DNA插入失活的是一個編碼肌醇1，3，4三磷酸-5/6激酶的基因OslTPK2/DSM3，該基因的轉(zhuǎn)錄水平在莖節(jié)及孕穗期葉片中表達量較高，在幼根幼穗中表達較低，且受干旱、高鹽及ABA處理誘導(dǎo)上升表達，該基因編碼一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白催化由肌醇三磷酸(IP3)生成肌醇四磷酸(IP4)的反

7、應(yīng)，此過程也是肌醇多磷酸代謝途徑中的重要步驟之一。在干旱脅迫條件下，突變體dsm3對干旱非常敏感主要表現(xiàn)在脯氨酸、可溶性糖、花粉育性、結(jié)實率、生物量均顯著低于對照，而氧化脅迫產(chǎn)物丙二醛含量顯著高于對照表明突變體的抗氧化能力顯著降低，可能是由于突變體在干旱脅迫條件下，信號分子肌醇三磷酸代謝紊亂，導(dǎo)致干旱信號的傳導(dǎo)不正常。構(gòu)建人造小RNA抑制內(nèi)源DSM3基因的表達，轉(zhuǎn)基因陽性植株在干旱與高鹽脅迫下與突變體表型一致。然而，DSM3基因的超量表

8、達植株同樣表現(xiàn)出對干旱和高鹽的敏感性，而超表達植株非逆境相關(guān)生理指標也表現(xiàn)出與突變體相似的表型。高效液相色譜結(jié)果表明超表達植株中二級信使肌醇三磷酸(IP3)含量下降致使，突變體對干旱和高鹽敏感。此外，我們檢測了突變體和超表達植株在干旱脅迫前后一些非生物逆境相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)氧化脅迫相關(guān)基因表達量有顯著差異，表明肌醇三磷酸(IP3)含量的改變導(dǎo)致氧化損傷。DSM3同源序列比對發(fā)現(xiàn)水稻基因組中共有6個同源基因，但由于該家族基因基因結(jié)構(gòu)在基因家族

9、形成的過程中出現(xiàn)了不同的選擇，導(dǎo)致該家族成員表現(xiàn)出不同的逆境誘導(dǎo)表達模式和組織特異性表達模式。
　　 osetol1是一個抗旱但對澇害敏感突變體。該突變是由于T-DNA插入一個編碼含有BTB結(jié)構(gòu)域的E3連接酶基因而失活。該基因在我們突變體庫里有兩個等位突變體命名為osetol1-1和osetol1-2，該突變體表現(xiàn)為孕穗期在干旱脅迫條件下較高的結(jié)實率和生物量，但在澇脅迫條件下表現(xiàn)出較慢的生長速度。在水稻中超表達OsETOL1表現(xiàn)

10、出與突變體相反的表型。對OsETOL1的組織表達譜和非生物逆境表達譜分析發(fā)現(xiàn)，OsETOL1主要在成熟組織表達，可以被干旱和澇強烈誘導(dǎo)，而且表現(xiàn)出與該家族其余2個成員OsETOL2和OsETOL3不同的表達模式?；虮磉_分析發(fā)現(xiàn)OsETOL1主要影響淀粉代謝和糖酵解相關(guān)基因的表達，說明OsETOL1可能是能量代謝的調(diào)控子。酵母雙雜交和雙分子熒光互補分析發(fā)現(xiàn)OsETOL1可以與乙烯合成關(guān)鍵酶OsACS2互作，互作位置在細胞質(zhì)。此外，我們在

11、突變體庫中找到乙烯合成基因OsACS2的突變體osacs2。色譜分析表明在osacs2突變體和OsETOL1超表達水稻中ACC和乙烯含量顯著下降。此外，10μM外源ACC處理可以恢復(fù)osacs2突變體中和OsETOL1超表達水稻中因ACC缺陷導(dǎo)致的澇脅迫下生長較慢的表型。說明OsETOL1負調(diào)控乙烯合成的機制在水稻和擬南芥中是保守的，但遺傳和序列分析分析發(fā)現(xiàn)ETOL家族基因在水稻和擬南芥中既有功能的相似性同時也存在一定的差異。
　

12、　 OsGH3-2在非生物逆境抗性中也發(fā)揮重要功能。OsGH3-2編碼吲哚乙酸氨基化合成酶，研究發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控ABA的合成和非生物逆境的抗性，OsGH3-2基因受干旱誘導(dǎo)上升表達，低溫抑制OsGH3-2的表達。OsGH3-2超表達水稻表現(xiàn)出顯著的形態(tài)改變，如植株矮小、葉夾角增大、更小的劍葉、穗和節(jié)。此外，OsGH3-2超表達水稻還表現(xiàn)出冠根和根毛數(shù)目顯著降低。液相色譜分析發(fā)現(xiàn)OsGH3-2超表達水稻中a-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素顯著下降，

13、質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)游離IAA和ABA含量顯著下降。OsGH3-2超表達水稻在干旱脅迫條件下增加氣孔的開度和水分散失。然而，OsGH3-2超表達水稻表現(xiàn)出抵抗低溫脅迫和抗氧化損傷的能力?？赡苁怯捎贠sGH3-2超表達減少了游離IAA的含量，減輕了氧化損傷和低溫下細胞膜的透性。實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)ABA合成和一些非生物逆境相關(guān)基因的表達發(fā)生顯著變化。但是抑制OsGH3-2基因的表達沒有導(dǎo)致株型的改變，IAA、ABA含量和對非生物逆境的抗性也沒有

14、顯著差異，可能是由于OsGH3家族基因功能的冗余，對OsGH3家族基因表達譜和序列分析也發(fā)現(xiàn)該家族基因既存在功能的冗余性也表現(xiàn)出一定的特異性。
　　 ABA缺陷型突變體phs1 phs2 phs3 phs4和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片白化，體內(nèi)葉綠體及內(nèi)囊體膜發(fā)育畸形，我們用液相色譜儀-質(zhì)譜檢測了，這些植株體內(nèi)的類胡蘿卜素、ABA和IAA含量發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素和ABA顯著下降，體內(nèi)IAA的合成也顯著降低，在干旱脅迫條件下ABA缺

15、陷型植株保持比對照更高的氣孔開放率，在苗期干旱脅迫條件下phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片萎蔫顯著快于對照，嚴重干旱脅迫恢復(fù)后，phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的成活率顯著低于對照，表明phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株對干旱敏感，實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)，依賴于ABA信號的某些干旱應(yīng)答基因如編碼bZIP轉(zhuǎn)錄因子和LEA蛋白的一些基因，在干旱脅迫狀態(tài)下的phs3-1和PDS

16、-RNAi轉(zhuǎn)基因植株中誘導(dǎo)的強度顯著低于陰性對照。有趣的是我們發(fā)現(xiàn)，phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株對低溫表現(xiàn)出較高的抗性，這一點可能是由于phs3-1和PDS-RNAi轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源IAA含量顯著下降，減弱了低溫脅迫下植物膜系統(tǒng)的氧化損傷，并增強了低溫脅迫下細胞膜的穩(wěn)定性。為了確信ABA缺陷型植株體內(nèi)IAA含量的下降是由內(nèi)源ABA含量下降造成，我們用外源施加不同濃度的ABA合成抑制劑氟啶酮(fluridone)，抑制內(nèi)源ABA