南極絲瓜蘚耐逆相關(guān)功能基因的發(fā)掘和功能研究.pdf

1、南極陸地生態(tài)系統(tǒng)是寒冷、干燥和低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，并伴隨著急劇的溫度變化和極少的可利用水資源。由于嚴(yán)酷的氣候條件，植物主要生長(zhǎng)在南極大陸海岸線邊緣無(wú)冰雪覆蓋的陸地表層，通常是一小塊孤立的地方。隱花植物（苔蘚和地衣）是南極大陸最主要的植物類型，這些南極植物為發(fā)現(xiàn)新的功能基因和揭示極端環(huán)境適應(yīng)機(jī)制以及生物進(jìn)化提供了良好的材料。但是，到目前為止，對(duì)于南極苔蘚適應(yīng)極端環(huán)境條件的生存機(jī)制仍然不清楚。本研究中，我們利用Illumina公司的高通量測(cè)序技術(shù)分

2、析了南極絲瓜蘚（Pohlia nutans）在低溫、高鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組，從基因組水平上分析了一些重要抗逆基因的表達(dá)特征。此外，我們分析了類黃酮羥化酶和JAZ蛋白在南極絲瓜蘚（Pohlia nutans）適應(yīng)極端環(huán)境中的作用。本研究對(duì)于揭示南極苔蘚適應(yīng)極端環(huán)境機(jī)理，促進(jìn)極地特殊基因資源的開(kāi)發(fā)和利用具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　1、利用第二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析南極絲瓜蘚的抗逆相關(guān)功能基因
　　從基因組水平上研究南極絲瓜蘚（

3、Pohlia nutans）的功能基因在寒冷脅迫條件下的響應(yīng)特征，對(duì)于發(fā)掘抗逆相關(guān)基因及其在適應(yīng)極地極端環(huán)境中的作用十分重要。本研究在國(guó)內(nèi)外率先利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)分析了南極絲瓜蘚（Pohlia nutans）在正常條件下、低溫脅迫(4℃，6h)下和高鹽脅迫下(200mM NaCl，1h)的基因表達(dá)譜特征。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)已經(jīng)提交國(guó)際Short Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫(kù)，公開(kāi)注冊(cè)號(hào)為SRA051595;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

4、拼接之后的數(shù)據(jù)提交到DDBJ/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，公開(kāi)注冊(cè)號(hào)為GACA00000000。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后最終共得到93488的單一基因序列，平均長(zhǎng)度為405個(gè)堿基;單一基因序列大于500個(gè)堿基的共有18688個(gè)?；蚬δ茏⑨尠l(fā)現(xiàn)有16782個(gè)序列編碼已知功能蛋白;它們中多數(shù)都可以通過(guò)GO、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行聚類分析和代謝通路分析?；蚪M水平上的基因差異表達(dá)分析表明，在寒冷脅迫條件下有3796個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平顯著上調(diào)，有

5、1405個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平顯著下調(diào)。在鹽脅迫條件下有820個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平顯著上調(diào)，有350個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平顯著下調(diào)。并且，我們從南極絲瓜蘚轉(zhuǎn)錄組中共鑒定得到了816類受體蛋白激酶（receptor-like kinases）基因和1309轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)轉(zhuǎn)錄組的基因差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)類受體蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子和次生代謝關(guān)鍵酶等可能在南極苔蘚抗逆機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本文從基因組水平上分析了一些重要抗逆基因的表達(dá)特征，對(duì)于揭示南極苔蘚抗極端環(huán)

6、境的機(jī)制和極地基因資源的開(kāi)發(fā)具有重要作用。
　　2、JAZ蛋白在南極絲瓜蘚適應(yīng)極端環(huán)境中的作用及相關(guān)的分子機(jī)制研究
　　高鹽脅迫是限制許多農(nóng)作物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。茉莉酸和脫落酸在植物調(diào)節(jié)鹽脅迫的抗性過(guò)程中發(fā)揮重要作用。之前的研究表明JAZ(jasmonate ZIM-domain)轉(zhuǎn)錄抑制因子是茉莉酸信號(hào)途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。茉莉酸誘導(dǎo)JAZ蛋白與SCFCOIl泛素連接酶結(jié)合，導(dǎo)致JAZ蛋白通過(guò)26S蛋白酶體途徑被降解。但是，J

7、AZ蛋白在茉莉酸介導(dǎo)的植物對(duì)鹽脅迫抗性過(guò)程中發(fā)揮的作用仍然不清楚。
　　本研究中，我們從南極絲瓜蘚（Pohlia nutans）中克隆得到一個(gè)JAZ（簡(jiǎn)稱PnJAZ9，以下相同）基因，并對(duì)該基因的功能進(jìn)行了較為深入的分析?；虮磉_(dá)水平分析表明，PnJAZ9基因在低溫(4℃)、高鹽(200 mM NaCl)、聚乙二醇(20％ PEG6000)、脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)脅迫條件下表達(dá)水平顯著上調(diào);蛋白序列比對(duì)分析表明PnJAZ

8、9具有典型JAZ家族蛋白的ZIM和Jas結(jié)構(gòu)域。與擬南芥基因組中的17個(gè)JAZ轉(zhuǎn)錄因子一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，表明南極絲瓜蘚PnJAZ9基因與擬南芥AtJAZ9(TIFY7)的親緣關(guān)系最近。通過(guò)構(gòu)建“PnJAZ9-綠色熒光蛋白(GFP)”的瞬時(shí)表達(dá)載體，利用聚乙二醇(PEG4000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，在激光共聚焦顯微鏡下觀察PnJAZ9蛋白的亞細(xì)胞定位情況，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核中，僅有少量在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。
　　構(gòu)

9、建了PnJAZ9的過(guò)量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染擬南芥，篩選和繁種，最終獲得過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因純合植株。JAZ蛋白是茉莉酸途徑的負(fù)調(diào)控因子。研究表明，過(guò)表達(dá)PnJAZ9抑制了茉莉酸信號(hào)途徑。在100μM MeJA處理?xiàng)l件下，擬南芥PnJAZ9過(guò)表達(dá)株系的萌發(fā)率顯著高于野生型植株。實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)擬南芥過(guò)表達(dá)株系中茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MYC2和VSP1的表達(dá)水平顯著低于野生型植株。利用酵母雙雜交證實(shí)全長(zhǎng)PnJAZ9或者JAZ9(039

10、18)△ N△C蛋白都能夠與擬南芥AtMYC2、AtMYC3、AtMYC4轉(zhuǎn)錄因子相互作用。
　　過(guò)表達(dá)南極絲瓜蘚PnJAZ9增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株在種子的萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育階段對(duì)高鹽脅迫的抗性。在100 mM NaCl處理?xiàng)l件下培養(yǎng)6天時(shí)，野生型植株的種子幾乎沒(méi)有萌發(fā)，而過(guò)表達(dá)系A(chǔ)tOE1、AtOE2和AtOE3的種子萌發(fā)率分別為47.06％、44.71％和56.47％。同時(shí)，過(guò)表達(dá)南極絲瓜蘚PnJAZ9也增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)滲透脅迫的

11、抗性;在0.2M或者0.3M甘露醇脅迫條件下，過(guò)表達(dá)系(AtOE)的種子萌發(fā)率顯著高于野生型植株種子的萌發(fā)率（處理6天后的種子）。
　　在種子萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育階段，過(guò)表達(dá)PnJAZ9提高了植株對(duì)ABA脅迫的抗性。在0.25μM ABA處理?xiàng)l件下，過(guò)表達(dá)系A(chǔ)tOE1、AtOE2和AtOE3的種子萌發(fā)率分別是94.87％、84.64％和92.31％（處理6天的種子萌發(fā)率），然而野生型植株種子萌發(fā)率僅為25.64％。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表

12、達(dá)植株對(duì)葡萄糖和生長(zhǎng)素(IAA)產(chǎn)生明顯抗性，表現(xiàn)出與擬南芥ABI4或ABI5（ABA途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子）等突變體相似的表型。由此推測(cè)，在轉(zhuǎn)基因植株中，過(guò)表達(dá)PnJAZ9可能抑制了ABA信號(hào)途徑中的某些關(guān)鍵的正調(diào)控因子例如ABI4和ABI5。進(jìn)而，我們利用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)檢測(cè)了ABA途徑中與種子萌發(fā)相關(guān)的基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)植株ABA途徑中關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因ABI4、ABI5、RD22a、RD29a和MYB2等都呈

13、顯著的下調(diào)表達(dá)模式。
　　綜上所述，我們推測(cè)南極絲瓜蘚PnJAZ9蛋白可能通過(guò)與ABA信號(hào)途徑中的正調(diào)控因子相互作用，參與調(diào)解植物在高鹽脅迫條件下茉莉酸和脫落酸兩個(gè)信號(hào)途徑之間復(fù)雜的相互作用過(guò)程。
　　3、南極絲瓜蘚類黃酮羥化酶的系統(tǒng)進(jìn)化和非生物脅迫下表達(dá)模式分析
　　類黃酮是一類廣泛存在的植物次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物學(xué)功能，包括植物的防御反應(yīng)、抗紫外輻射、生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制、植物化感作用、花器官成色等。黃酮類化合物在

14、植物從水生轉(zhuǎn)移到陸地環(huán)境的早期演化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在類黃酮的合成過(guò)程中，類黃酮的羥基化修飾作用對(duì)于其顯色、穩(wěn)定性和抗氧化能力的功能至關(guān)重要。類黃酮-3'-羥化酶(F3'Hs)和類黃酮-3'，5'-羥化酶(F3'，5'Hs)屬于細(xì)胞色素P450蛋白家族，它們分別催化類黃酮B環(huán)3'或3'，5'位置的羥基化反應(yīng)。但是，到目前為止在較低等的植物（例如，苔和蘚）中類黃酮羥化酶的作用仍然沒(méi)有報(bào)道。本研究中，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和RA

15、CE擴(kuò)增技術(shù)，從南極絲瓜蘚中共克隆得到了16條類黃酮3'羥基化酶(F3'H)和類黃酮3'，5'羥基化酶(F3'，5'H)基因的全長(zhǎng)序列。蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，它們都具有典型的類黃酮羥化酶的結(jié)構(gòu)域，即包括富含脯氨酸的“鉸鏈”結(jié)構(gòu)域、EXXR基序、結(jié)合氧分子的“口袋”基序和亞鐵血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域及底物識(shí)別位點(diǎn)。之前對(duì)類黃酮羥化酶基因的研究報(bào)道均指出，來(lái)自同一祖先的類黃酮-3'-羥化酶和類黃酮-3'，5'-羥化酶是在裸子植物和被子植物發(fā)生進(jìn)化分

16、離時(shí)開(kāi)始獨(dú)立進(jìn)化的。本研究中，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析我們發(fā)現(xiàn)，南極絲瓜蘚和小立碗蘚中類黃酮-3'-羥化酶和類黃酮-3'，5'-羥化酶這兩個(gè)家族的蛋白都是完全分開(kāi)的，即類黃酮-3'-羥化酶或者類黃酮-3'，5'-羥化酶分別地聚類在一起。因此，我們確認(rèn)類黃酮-3'-羥化酶和類黃酮-3'，5'-羥化酶在進(jìn)化上的分離從苔蘚類植物開(kāi)始就已經(jīng)發(fā)生了。類黃酮羥化酶基因的差異表達(dá)、類黃酮羥化酶在細(xì)胞中的比例（即F3'H∶ F3'，5'H）將直接影響類黃酮化合

17、物的種類和分布，最終可能影響植物在逆境脅迫條件下的生存能力。本研究中，我們利用RT-qPCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，低溫、高鹽、干旱、紫外輻射、植物激素脫落酸和茉莉酸等都能夠影響南極絲瓜蘚中類黃酮羥化酶基因的表達(dá)水平。過(guò)表達(dá)類黃酮-3'-羥化酶(MFC00060)使植株在種子萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育階段對(duì)NaCl和ABA的抗性降低，但是提高了過(guò)表達(dá)系植株對(duì)過(guò)氧化氫脅迫的抗性。黃酮類化合物作為一種活性氧清除劑，其含量體現(xiàn)了不同植物在生化方面對(duì)氧化脅迫的抗