膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)中幾種相關(guān)蛋白的表達(dá)純化與結(jié)晶.pdf

1、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和融合過程在膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞分泌途徑中發(fā)揮重要的功能。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)是唯一一個響應(yīng)胰島素刺激轉(zhuǎn)運(yùn)上膜的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員,它在胰島素作用下的轉(zhuǎn)運(yùn)上膜是血糖調(diào)控的一個重要過程。GLUT4儲存囊泡(GSV)的轉(zhuǎn)運(yùn)和融合涉及復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用,其中Synip與Stx4的結(jié)合影響SNARE復(fù)合物的形成來阻斷GSV的融合。為了獲得蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu),本研究首創(chuàng)了一種原核重組共表達(dá)系統(tǒng),成功獲得Stx4與SynipC端的蛋

2、白質(zhì)復(fù)合物,這項(xiàng)工作為進(jìn)一步研究Stx4與Synip復(fù)合物的相互作用與晶體結(jié)構(gòu)提供了良好的基礎(chǔ)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Stx4與Synip可能是以1:1的分子比例形成復(fù)合物,并且Stx4蛋白的N端1~28個氨基酸不參與相互作用。
　　在細(xì)胞中發(fā)揮著重要功能的Ⅳ型膜蛋白是一類特殊的膜蛋白,也稱為尾部錨定蛋白,包括囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的SNARE蛋白,細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bcl-2,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白通道Sec61β等等。TRC40蛋白能夠識別Ⅳ型膜蛋白新生肽

3、鏈的跨膜區(qū),并協(xié)助其轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。在本研究中,通過原核重組表達(dá)和層析純化后,以懸滴氣相擴(kuò)散法獲得了TRC40全長蛋白質(zhì)的晶體,晶體衍射分辨率達(dá)到2埃,初步晶體學(xué)分析顯示一個不對稱單位中、含有兩個蛋白分子。晶體結(jié)構(gòu)解析工作正在進(jìn)行中。本研究為TRC40蛋白的結(jié)構(gòu)解析乃至了解Ⅳ型膜蛋白的翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制奠定了重要的基礎(chǔ)。
　　鈣釋放激活鈣(CRAC)通道介導(dǎo)的胞外鈣離子進(jìn)入胞內(nèi)的方式是細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加的最主要方式,在細(xì)胞中特別在免疫

4、系統(tǒng)的細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)單次跨膜蛋白STIM1蛋白被鑒定為細(xì)胞鈣庫中鈣離子的感受器和CRAC通道的激活分子,當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫損耗時,STIM1通過位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的N端EF手性結(jié)構(gòu)與SAM結(jié)構(gòu)域感應(yīng)鈣離子豐度從而刺激CRAC通道的開放。本研究重組表達(dá)和純化了大量高純度的6*His標(biāo)記的重組STIM1蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的 N端結(jié)構(gòu)域,并對STIM1蛋白N端結(jié)構(gòu)域的結(jié)晶條件進(jìn)行了摸索,初步獲得C端6*His標(biāo)記的STIM1蛋白N端結(jié)構(gòu)域的針