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文檔簡介
1、目的:建立人腹膜間皮細胞(HPMC)原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和鑒定方法;觀察含有不同成分的培養(yǎng)基對HPMC存活和生長的影響;研究HPMC是否表達尿素轉(zhuǎn)運蛋白(UT)。 方法:從腹膜透析(PD)患者透析流出液中提取原代HPMC和用網(wǎng)膜胰酶消化法,進行HPMC原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng);用免疫組化方法對培養(yǎng)的細胞進行鑒定;用MTT法觀察含有不同成分的培養(yǎng)基對HPMC存活和生長的影響;用酚-氯仿法抽提HPMC的總RNA,在GeneBank數(shù)據(jù)庫中查
2、找到UT-B的mRNA序列,應用Primer3軟件在其保守序列設計1對引物,通過RT-PCR法擴增該片段,并以高表達UT的人腎髓質(zhì)為對照,檢測HPMC是否表達UT-B。 結(jié)果: (1)細胞懸液分離法及網(wǎng)膜胰酶消化法均為良好的HPMC分離方法;經(jīng)HE染色,在光學顯微鏡下觀察,細胞呈多角形、扁圓形,大小不等;細胞漿豐富,薄染為淡紅色,著色均勻;細胞為單核,偶有雙核或多核;核染色質(zhì)顆粒狀,分布均勻,有時核內(nèi)可見1-2個小核仁,
3、形態(tài)學上符合人腹膜間皮細胞特征;經(jīng)免疫組織化學法染色,在光鏡下觀察所培養(yǎng)細胞的細胞角蛋白和波形蛋白染色均為陽性,所培養(yǎng)的細胞的第Ⅷ因子相關(guān)抗原及白細胞CD45抗原染色均呈陰性,免疫組化實驗所設定的陰性對照均按預期結(jié)果呈現(xiàn)陰性染色,免疫組化鑒定證實所培養(yǎng)的細胞為HPMC,其純度可達96%以上。 (2)含有不同成分的培養(yǎng)基對HPMC的存活和生長有影響;加用20%胎牛血清、胰島素、氫化可的松可改善HPMC的存活,促進HPMC的生長,其
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