人腹膜間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)與尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)研究.pdf

1、目的：建立人腹膜間皮細(xì)胞（HPMC）原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和鑒定方法；觀察含有不同成分的培養(yǎng)基對HPMC存活和生長的影響；研究HPMC是否表達(dá)尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（UT）。 方法：從腹膜透析（PD）患者透析流出液中提取原代HPMC和用網(wǎng)膜胰酶消化法，進(jìn)行HPMC原代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)；用免疫組化方法對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定；用MTT法觀察含有不同成分的培養(yǎng)基對HPMC存活和生長的影響；用酚-氯仿法抽提HPMC的總RNA，在GeneBank數(shù)據(jù)庫中查

2、找到UT-B的mRNA序列，應(yīng)用Primer3軟件在其保守序列設(shè)計(jì)1對引物，通過RT－PCR法擴(kuò)增該片段，并以高表達(dá)UT的人腎髓質(zhì)為對照，檢測HPMC是否表達(dá)UT-B。 結(jié)果： （1）細(xì)胞懸液分離法及網(wǎng)膜胰酶消化法均為良好的HPMC分離方法；經(jīng)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈多角形、扁圓形，大小不等；細(xì)胞漿豐富，薄染為淡紅色，著色均勻；細(xì)胞為單核，偶有雙核或多核；核染色質(zhì)顆粒狀，分布均勻，有時(shí)核內(nèi)可見1-2個(gè)小核仁，

3、形態(tài)學(xué)上符合人腹膜間皮細(xì)胞特征；經(jīng)免疫組織化學(xué)法染色，在光鏡下觀察所培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白和波形蛋白染色均為陽性，所培養(yǎng)的細(xì)胞的第Ⅷ因子相關(guān)抗原及白細(xì)胞CD45抗原染色均呈陰性，免疫組化實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的陰性對照均按預(yù)期結(jié)果呈現(xiàn)陰性染色，免疫組化鑒定證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為HPMC，其純度可達(dá)96％以上。 （2）含有不同成分的培養(yǎng)基對HPMC的存活和生長有影響；加用20％胎牛血清、胰島素、氫化可的松可改善HPMC的存活，促進(jìn)HPMC的生長，其