晚期氧化蛋白產(chǎn)物通過活性氧誘導人腹膜間皮細胞TGF-β-,1-的表達.pdf

1、目的：晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products，AOPP)是witko-Sarsat等人于1996年首次報道的由尿毒癥血液透析患者血漿中分離出的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，作為氧化應激(oxidative stress，OS)新的標志物，是有一定生物學活性的促炎癥反應介質(zhì)。AOPP作為尿毒癥毒素分子參與慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)和透析患者臨床一些并發(fā)癥發(fā)生的病理生

2、理過程。本研究旨在通過人工合成晚期氧化蛋白產(chǎn)物．人血清白蛋白(AOPP．HSA)模型誘導體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細胞(humanperitoneal mesothelial cells，HPMCs)對TGF-β<,1>表達的影響及內(nèi)源性活性氧(reagtive oxygen species，ROS)在此過程中的調(diào)節(jié)機制，來探討AOPP與維持性腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAP

3、D)相關腹膜纖維化之間的關系，從而為臨床防治腹膜纖維化提供理論依據(jù)。 方法：采用Witko-Sarsat等介紹的方法，分別按照摩爾比為1/12.5、1/25、1/50、1/100將無內(nèi)毒素的人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)與次氯酸溶液反應，體外制備出四種不同氧化修飾程度的AOPP-HSA模型。從CAPD治療的CKD患者腹膜透析流出液中分離并在含10﹪胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中原代培養(yǎng)人腹膜

4、間皮細胞，第二代細胞應用免疫組化方法進行細胞鑒定，第三代細胞用于實驗，分別按照不同的實驗要求分成濃度依賴組、時間依賴組、藥物干預組。采用ELISA法檢測HPMCs上清液中TGF-β<,1>蛋白水平，采用逆轉錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR)半定量分析HPMCs中TGF-β<,1>mRNA的基因表達水平，同時應用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)對氧化劑敏感的2，7-二氫二氯熒光素(DCFH)發(fā)生氧化所產(chǎn)生的熒光量，從而間接的反映細胞內(nèi)活性氧的生成水平。

5、分別用不同濃度的抗氧化劑維生素E(12.5μmol/L、25.1μmol/L、50μmol/L)，和N-乙酰半胱胺酸(0.1 mmol/L、1.0mmol/L、10mmol/L)預處理細胞，觀察抗氧化劑對HPMCs內(nèi)源性ROS及TGF-β<,1>表達的影響。結果： 1．AOPP-HSA能顯著誘導人腹膜間皮細胞TGF-β<,1>的分泌與基因表達，呈劑量依賴方式(P<0.01)，在0-48h內(nèi)TGF-β<,1>的分泌與基因表達隨時間

6、的延長而增多，呈正相關關系(P<0.05)，在48h達到高峰(P<0.01)，隨后出現(xiàn)降低。并且也與HSA/HOCL摩爾比成正相關關系(P<0.01)。 2．AOPP-HSA也明顯增加腹膜間皮細胞ROS的生成量，呈劑量依賴方式(P<0.01)，在0、15、30min時間內(nèi)平均熒光強度變化與時間呈依賴方式，在30min達到高峰(t=-26.073，P<0.01)，隨后在60min、120min內(nèi)逐漸下降(t=-20.607、-11

7、.813，P均<0.05)。并且也與HSA/HOCL摩爾比成正相關關系(P<0.01)。 3．分別用不同濃度的抗氧化劑維生素E(12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L)和N-乙酰半胱胺酸(0.1 mmol/L、1.0mmol/L、10mmol/L)預處理細胞，與PBS對照組相比，可明顯地降低細胞內(nèi)ROS的生成量，同時顯著地抑制AOPP-HSA誘導人腹膜間皮細胞TGF-β<,1>的分泌與基因表達，呈劑量依賴方式(

8、P<0.01)，其中維生素E(50μmol/L)組和NAC(10mmol/L)組抑制更加顯著。 4．未經(jīng)HOCL修飾的HSA不能顯著的誘導人腹膜間皮細胞TGF-β<,1>的分泌與基因表達及增加細胞ROS的生成量，與PBS對照組比較，無顯著的統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 結論： 1．體外制備的AOPP-HSA可顯著誘導人腹膜間皮細胞TGF-β<,1>的分泌與基因表達，部分可能通過內(nèi)源性ROS介導細胞內(nèi)信號轉導途徑調(diào)

9、節(jié)此過程，提示AOPP可能通過增加體內(nèi)氧化應激參與腹膜纖維化的形成過程。 2．體外制備的AOPP-HSA可刺激人腹膜間皮細胞呼吸爆發(fā)，而抗氧化劑維生素E和N-乙酰半胱胺酸可顯著降低細胞ROS的生成量。 3．維生素E和N-乙酰半胱胺酸作為抗氧化劑通過清除細胞ROS而顯著抑制TGF-β<,1>的分泌與基因表達。 4．此研究揭示抗氧化劑在防治腹膜纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中可能是一種有效的藥物，為抗氧化劑在臨床上的應用提供可