TGF-β1在大鼠腹膜間皮細(xì)胞中的促炎作用及機(jī)制.pdf

1、腹膜透析是治療急、慢性腎功能衰竭的主要腎臟替代方法之一。腹膜透析相對于血液透析有諸多的優(yōu)越性，但感染性腹膜炎仍是腹膜透析最常見的并發(fā)癥，影響患者透析療效和病死率，同時(shí)也造成腹膜組織學(xué)改變。腹膜炎的發(fā)生使大量巨噬細(xì)胞進(jìn)入腹腔，由此產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子可損害腹膜問皮細(xì)胞，使腹膜間皮細(xì)胞衰老及間皮層缺失，加重腹膜纖維化，導(dǎo)致腹膜功能進(jìn)行性喪失。因此，探討腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的發(fā)生機(jī)制具有重要的臨床意義。 轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1

2、)是一種多功能的細(xì)胞因子，它參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，并調(diào)節(jié)纖維結(jié)合素和膠原的表達(dá)，過量的TGF-β1參與組織纖維化的過程。TGF-β1的多種生理功能是與它能調(diào)節(jié)多種不同的生長因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生密切相關(guān)的。 我們既往的研究著重于探討TGF-β1在對腹膜纖維化過程的影響，研究結(jié)果表明TGF-β/Smads信號蛋白參與了腹膜纖維化的過程。大量研究顯示TGF-β1具有免疫抑制的作用，但我們前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)表達(dá)sma

3、d7，不僅減輕了大鼠腹膜的纖維化程度，也減輕了其局部的炎癥反應(yīng)。因此，為了進(jìn)一步探討TGF-β1對腹膜炎有何影響及其可能機(jī)制，我們設(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn)：1．首先用TGF-β1(10ng/ml)刺激體外培養(yǎng)的腹膜間皮細(xì)胞，觀察其對趨化因子(MCP-1、IL-8)和炎癥因子(TNF-α)表達(dá)的影響； 2．體外轉(zhuǎn)染Smad7至RPMCs，再用TGF-β1(10ng/ml)刺激，觀察其對趨化因子(MCP-1、IL-8)和炎癥因子(TNF-d)表達(dá)的影

4、響3．先用p38抑制劑SB203580(10umol/L)預(yù)處理RPMCs，再用TGF·β1(10ng/ml)刺激，觀察其對趨化因子(MCP-1、IL-8)和炎癥因子(TNF-α)表達(dá)的影響；4．體外轉(zhuǎn)染Smad7至RPMCs，再用TGF-β1(10ng/ml)刺激，觀察其對p38表達(dá)的影響。一．TGF-β1對大鼠腹膜問皮細(xì)胞表達(dá)炎癥因子和趨化因子的影響(一)方法分離、培養(yǎng)SD雄性大鼠腹膜問皮細(xì)胞。用TGF-β1(10ng/ml)體外作

5、用于大鼠腹膜間皮細(xì)胞，檢測不同時(shí)間(0，1h，3h，6h，12h，24h，48h)點(diǎn)趨化因子(MCP-1、IL-8)和炎癥因子(TNF-α)表達(dá)的變化。分別用RT-PCR，ELISA方法檢測mRNA水平和蛋白水平的變化。 (二)結(jié)果 TGF-β1可使腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生與分泌趨化因子和炎癥因子增多，RT-PCR結(jié)果顯示，與0h對照組相比，MCP-1在3h，6h，12h和24h組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)與0h對照組相比，I

6、L-8在3h，6h，12h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Oh對照組相比，TNF-α在3h，6h，12h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)．ELISA結(jié)果顯示，MCP-1在6h表達(dá)明顯增加，在24～48h達(dá)高峰，與Oh對比，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。 二．Smad7對TGF-β 1刺激大鼠腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和炎癥因子的影響(一)方法脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Flag-M2-Smad7至大鼠腹膜間皮細(xì)胞，用pEGFP-Cl熒光報(bào)告

7、基因，RT-PCR法和Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染的效率和特異性。轉(zhuǎn)染Smad7 24h后，TGF-β1(10ng/ml)再作用于大鼠腹膜問皮細(xì)胞24h，分別用RT-PCR，ELISA方法檢測Smad7對TGF-β1刺激大鼠腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和炎癥因子的影響。 (二)結(jié)果1．脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Smad7于大鼠腹膜間皮細(xì)胞的效率和特異性： 轉(zhuǎn)染有效率可達(dá)60﹪以上；空載體組不表達(dá)Flag-M2-Smad7基因及M2-Smad7

8、蛋白，轉(zhuǎn)基因組特異性表達(dá)Flag-M2-Smad7基因及M2-Smad7蛋白。 2．趨化因子和炎癥因子的變化： 上調(diào)Smad7可明顯抑制TGF-β1刺激大鼠腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌趨化因子和炎癥因子的作用。 三．p38抑制劑SB203580對TGF-β 1刺激大鼠腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和炎癥因子的影響(一)方法p38抑制劑SB203580預(yù)處理RPMCslh后，TGF-β1(10ng/ml)再作用于大鼠腹膜問皮細(xì)

9、胞24h，分別用RT-PCR，ELISA方法檢測p38抑制劑SB203580對TGF-β1刺激大鼠腹膜問皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和炎癥因子的影響。 (二)結(jié)果 p38抑制劑SB203580可明顯抑制TGF-β1刺激大鼠腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌趨化因子和炎癥因子的作用。 四．TGF-β1及其信號蛋白對p38MAPK通路的影響(一)方法脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Flag-M2-Smad7至大鼠腹膜間皮細(xì)胞，用pEGFP-Cl熒光報(bào)告基因

10、，RT-PCR法和Western Blot方法檢測轉(zhuǎn)染的效率和特異性。轉(zhuǎn)染Smad7 24h后，TGF-β1(10ng/ml)再作用于大鼠腹膜問皮細(xì)胞30min，用Western Blot方法檢(二)結(jié)果1．脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Smad7于大鼠腹膜間皮細(xì)胞的效率和特異性： 轉(zhuǎn)染有效率可達(dá)60﹪以上；空載體組不表達(dá)Flag-M2-Smad7基因，轉(zhuǎn)基因組特異性表達(dá)Flag-M2-Smad7基因；空載體組不表達(dá)Flag-M2-Smad7蛋白，

11、轉(zhuǎn)基因組表達(dá)Flag-M2-Smad7蛋白。 2．P38表達(dá)的變化： TGF-β1能活化p38磷酸化的過程，上調(diào)Smad7可抑制TGF-β1對它們的激活反應(yīng)。 結(jié)論： 1．TGF-β1可刺激大鼠腹膜間皮細(xì)胞合成與分泌趨化因子(MCP-1、IL-8)和癥因子(TNF-α)。 2．上調(diào)Smad7可明顯抑制TGF-β1刺激大鼠腹膜問皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌趨化因子和炎癥因子的作用。 3．p38抑制劑SB