基于大鼠腹膜間皮細胞TGF-β-Smad信號途徑研究川芎嗪納米噴霧劑抗實驗性腹腔粘連作用機制.pdf

1、目的:外科臨床至今沒有防治術后腹腔粘連統(tǒng)一而廣泛應用的好辦法，預防腹腔粘連藥物的優(yōu)化及機理研究一直是外科臨床及基礎研究的重點和熱點之一。中醫(yī)藥在防治術后腹腔粘連方面具有多環(huán)節(jié)多靶點發(fā)揮作用、毒副作用小且價格低廉的優(yōu)勢，這其中川芎嗪脫穎而出，受到學者們的關注。導師及其研究團隊長期以來一直致力于中醫(yī)藥防治術后腹腔粘連的研究工作，對川芎嗪防治術后腹腔粘連也進行了專項研究，在完成了川芎嗪納米噴霧劑的制備并建立了質量監(jiān)控體系后，證實了川芎嗪納米噴

2、霧劑具有抑制腹腔粘連模型腹腔液中粘連相關因子TGF-β1、FN、CTGF的升高和調節(jié)纖溶系統(tǒng)t-PA、PAI平衡的作用。結合腹膜間皮細胞在腹腔粘連形成過程中的重要作用及TGF-β這一粘連形成機制中關鍵的靶點，我們開展本項研究，旨在進一步明確川芎嗪納米噴霧劑藥效的同時研究其影響腹膜間皮細胞結構和功能的機制，及在TGF-β致組織粘連過程中川芎嗪納米噴霧劑如何調控TGF-β/Smad信號途徑及下游靶基因的表達，從而深入川芎嗪納米噴霧劑防治腹腔

3、粘連的作用機理研究。
　　川芎嗪納米噴霧劑防治大鼠實驗性腹腔粘連藥效學研究部分:
　　方法:1、銼刀法建立大鼠實驗性腹腔粘連模型。SD大鼠120只，隨機分成4組，每組30只。A組空白組:造模后不使用任何藥物，直接關腹;B組川芎嗪原料組:關腹前創(chuàng)面涂抹川芎嗪原料溶液，5 ml/kg;C組川芎嗪納米噴霧劑組，關腹前創(chuàng)面噴涂川芎嗪納米噴霧劑，5 ml/kg;D組透明質酸鈉組:關腹前創(chuàng)面涂抹1％透明質酸鈉凝膠，0.5 ml/kg。2

4、、各組分別于術后1、3、5、7、14d隨機抽取6只大鼠，處死開腹，根據(jù)Phillips五分級標準、觀察盲腸受損處粘連情況，分別評分記錄。取盲腸受損創(chuàng)面組織進行病理檢測和透射電鏡檢測，對腹腔粘連形成過程及川芎嗪納米噴霧劑對不同階段干預后盲腸受損創(chuàng)面的病理形態(tài)及超微結構進行觀察。
　　結果:1、從整體層次，能降低大鼠腹腔粘連的發(fā)生率，降低粘連的分級評分;2、從病理形態(tài)學層次，能明顯抑制盲腸受損創(chuàng)面組織成纖維細胞和結締組織增生;3、從超

5、微結構層次，能改善盲腸受損創(chuàng)面組織間皮細胞受損后結構的破壞，抑制成纖維細胞的轉變。
　　結論:川芎嗪納米噴霧劑具有確切的防治大鼠實驗性腹腔粘連的效果。
　　川芎嗪納米噴霧劑保護大鼠腹膜間皮細胞的實驗研究部分:
　　方法:1、胰酶消化法體外培養(yǎng)出大鼠腹膜間皮細胞(RPMCs)，免疫組化進行鑒定;2、MTT法測定川芎嗪納米噴霧劑對正常RPMCs和經(jīng)Tnf-α誘導的RPMCs活性的影響;
　　結果:1、分離培養(yǎng)的細胞經(jīng)

6、鑒定為RPMCs;2、川芎嗪納米制劑對正常RPMCs的活性沒有影響，經(jīng)Tnf-α誘導的RPMCs活性顯著性下降，而川芎嗪納米制劑能夠抑制經(jīng)Tnf-α誘導的RPMCs活性下降，對RPMCs有一定的保護作用;
　　結論:川芎嗪納米制劑通過抑制受損RPMCs的活性下降而保護RPMCs。
　　川芎嗪納米噴霧劑調控大鼠腹膜間皮細胞TGF-β/Smad信號途徑的實驗研究部分:
　　方法:1、體外培養(yǎng)大鼠腹膜間皮細胞并鑒定;2、經(jīng)T

7、nf-α誘導RPMCs，激活TGF-β/Smad信號途徑，RT-PCR檢測川芎嗪納米制劑干預下TGF-β1mRNA、Smad7mRNA的表達;3、川芎嗪納米制劑干預下細胞內p-Smad2/3的定位和蛋白表達免疫組化分析;4、川芎嗪納米制劑干預下細胞內TGF-β1、Smad7、FN、CTGF、PAI-1、和COL1的Western blot蛋白分析;
　　結果:1、分離培養(yǎng)的細胞經(jīng)鑒定為RPMCs;2、經(jīng)Tnf-α誘導的RPMCs的

8、TGF-β1mRNA表達明顯上調、Smad7mRNA表達明顯受到抑制，而川芎嗪納米制劑能抑制TGF-β1mRNA的表達、上調Smad7mRNA的表達;3、經(jīng)Tnf-α誘導的RPMCs的p-Smad2/3被激活轉核內聚，表達水平明顯上調，而川芎嗪納米制劑能抑制p-Smad2/3的轉位及表達水平;4、經(jīng)Tnf-α誘導的RPMCs的TGF-β1、FN、CTGF、COL1和PAI-1蛋白含量升高，Smad7的蛋白含量減少;川芎嗪納米制劑能降低T

9、GF-β1、FN、CTGF、COL1和PAI-1的蛋白含量，提高Smad7的蛋白含量;
　　結論:川芎嗪納米制劑能抑制TGF-β/Smad信號途徑的激活，進一步抑制其下游靶基因的表達，從而抑制腹膜纖維化，起到抗腹腔粘連的作用。
　　總結:研究從整體到局部再到微觀三個層次明確了川芎嗪納米噴霧劑防治大鼠實驗性腹腔粘連的效果，證實了川芎嗪納米噴霧劑對大鼠腹膜間皮細胞受損時結構和活性的保護作用，并明確了川芎嗪納米噴霧劑通過抑制TGF

10、-β1的表達，進而抑制Smad2/3核內聚和磷酸化水平，同時上調Smad7的表達，起到抑制TGF-β/Smad信號途徑的作用，進一步抑制其下游靶基因FN、CTGF、COL1和PAI-1的表達，從而抑制細胞外基質的生成和積聚及膠原的合成和堆積，最終防止腹膜纖維化，發(fā)揮防治腹腔粘連的作用。本研究獲得了川芎嗪納米噴霧劑致術后纖維化改變的功能依據(jù)，并結合下游靶基因激動/抑制情況，分析了其與Smad信號通路的關系及影響的可能機制，為川芎嗪納米噴霧