晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導人角質形成細胞凋亡機制的研究.pdf

1、目的：
　　利用人角質形成細胞的替代細胞——HaCaT細胞——進行離體實驗。HaCaT細胞是一種可在體外培養(yǎng)中保持永生化、非腫瘤化的人角質形成細胞系，它完整保留了角質形成細胞的分化能力，并與通過原代培養(yǎng)的細胞具有同等特性。這些特點使得它可代替原代培養(yǎng)細胞被普遍應用于相關研究領域。在此研究中，我們利用體外配制的AOPPs以不同的作用時間或不同的藥物濃度刺激正常的HaCaT細胞，檢測HaCaT細胞凋亡率及細胞凋亡相關標記物的表達，從而

2、探索AOPPs對角質形成細胞的影響及揭示創(chuàng)面不愈合的潛在反應機制。
　　方法：
　　1、氧化修飾蛋白AOPP-HSA的制備
　　2、HaCaT細胞的培養(yǎng)
　　3、細胞活性的測定
　　4、FACS法檢測細胞凋亡
　　5、線粒體膜電位的檢測
　　6、活性氧ROS的測定
　　7、Western blot檢測目的蛋白表達
　　8、統(tǒng)計學分析
　　結果:
　　1、AOPPs誘導Ha

3、CaT細胞凋亡
　　MTT細胞活性檢測結果示，在400μg/mL AOPP-HSA作用下HaCaT細胞存活率在46.72±0.64％，而0-200μg/mL AOPP-HSA作用下HaCaT細胞存活率大于85％。因此，為探究AOPPs對HaCaT細胞凋亡的影響，實驗采用50，100及200μg/mL濃度的AOPP-HSA對細胞刺激24h或用100μg/mLAOPP-HSA刺激細胞0、15min、30min、45min、1h、2h、

4、6h、12h及24h，并用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。流式細胞儀檢測結果示，NC組（DMEM完全培養(yǎng)基處理組，下同）HaCaT細胞凋亡率為2.70±0.12％，HSA組（未修飾的HSA處理組，下同）HaCaT細胞凋亡率為2.45±0.47％，50μg/mL AOPP-HSA組HaCaT細胞凋亡率為18.59±3.52％，100μg/mL AOPP-HSA組HaCaT細胞凋亡率為20.81±3.14％，200μg/mL AOPP-HSA組H

5、aCaT細胞凋亡率為22.92±4.14％。與未修飾的HSA及DMEM完全培養(yǎng)基相比，AOPP-HSA可顯著誘導HaCaT細胞凋亡(P＜0.05)，且隨AOPP-HSA作用濃度的升高，凋亡率升高(P＜0.05);100μg/mL AOPP-HSA作用于HaCaT細胞后，12h及24h細胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)，且24h凋亡率(11.77±3.80％)高于12h凋亡率(20.88±2.93％)。
　　2、AOPPs使HaCa

6、T細胞線粒體膜電位下降
　　正常細胞中MMP維持在相對高水平，JC-1在線粒體內聚集成聚合物（紅色熒光），當細胞凋亡時，MMP降低，JC-1以單體形式（綠色熒光）存在細胞質內。本實驗中，MMP檢測結果提示，與NC組及HSA組相比，AOPP-HSA處理組HaCaT細胞紅色熒光減低、綠色熒光增多;隨著AOPP-HSA濃度升高，HaCaT細胞紅色熒光亮度隨之降低、綠色熒光隨之增強。這些結果提示，AOPPs可使HaCaT細胞MMP下降。<

7、br>　　3、AOPPs刺激HaCaT細胞內caspase家族及PARP-1蛋白的表達
　　細胞凋亡過程中，有許多蛋白的表達發(fā)生變化，比如Bcl-2家族、caspase家族及PARP-1。為探究AOPPs刺激后的HaCaT細胞凋亡過程中這些蛋白是否參與反應，我們利用Western blot檢測相關目的蛋白的表達情況。檢測結果顯示:AOPP-HSA作用后30min，PARP-1的表達開始增加，其表達高峰出現(xiàn)在2h（是藥物作用前表達量

8、的9.67倍，P＜0.05）。AOPP-HSA作用后15min，促凋亡蛋白Bax表達開始增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達開始減少，Bax/Bcl-2比值在24h達到最大值(16.71±1.42)。Caspas9及Caspase3前體在AOPPs作用后2h開始減少，同時活化的cleaved caspase9及cleaved caspase3表達開始增加(P＜0.05)。隨著AOPP-HSA濃度的增加，PARP-1，cleaved casp

9、ase9，cleaved caspase3及Bax的表達逐漸增多，而Bcl-2的表達逐漸減少(P＜0.05)。
　　4、AOPPs通過NADPH氧化酶途徑促進HaCaT細胞中ROS的生成
　　已有相關研究證明氧化應激反應下，細胞內過多的ROS可促進HaCaT細胞凋亡。為明確作為氧化蛋白產(chǎn)物的AOPPs能否促進HaCaT細胞內ROS的生成，我們對AOPPs作用后的HaCaT細胞進行了胞內ROS水平的檢測。檢測結果顯示，隨著AO

10、PP-HSA作用時間的延長或濃度的升高，HaCaT細胞內ROS水平隨之增高（P＜0.05）。
　　NADPH氧化酶(NOX)是ROS產(chǎn)生的主要來源之一，我們分別用NAC(N-acetylcysteine，ROS清除劑)、DPI(diphenylene iodonium，NOX抑制劑)及Apopcynin(NOX抑制劑)預先作用于HaCaT細胞，隨后檢測AOPPs對細胞內ROS產(chǎn)生的影響。結果顯示，NAC、DPI及Apopcynin

11、均可以顯著抑制胞內ROS生成，這一結果提示AOPPs可能通過NOX途徑促進HaCaT細胞內ROS的生成(P＜0.05）。
　　5、AOPPs通過NOX4—ROS—MAPK—caspase cascade—PARP-1通路誘導HaCaT細胞凋亡
　　Western blot檢測結果示，AOPPs刺激后，HaCaT細胞內NOX4蛋白表達自30min起開始增加、2h時達到高峰(藥物作用前的10.42倍，P＜0.05)，p-ERK1

12、/2及p-p38 MAPK從1h開始逐漸增加;且這三種目的蛋白隨AOPPs-HSA濃度升高表達逐漸增強(P＜0.05)。為進一步明確NOX4—ROS—MAPK—caspase cascade—PARP-1通路在HaCaT細胞凋亡中的作用，我們分別用U0126(ERK上游抑制劑)、SB203580(p38 MAPK抑制劑)、Z-VAD-fmk（caspase廣譜抑制劑）、NAC、DPI及Apocynin對細胞進行預處理，western b

13、lot檢測終末目的蛋白PARP-1的表達。結果顯示，在這些抑制劑的保護作用下，AOPPs刺激后的HaCaT細胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)、細胞表達的PARP-1蛋白顯著減少(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.AOPPs可誘導HaCaT細胞凋亡。
　　2.AOPPs主要通過NOX途徑誘導HaCaT細胞產(chǎn)生大量ROS
　　3.AOPPs通過NOX4—ROS—MAPK—caspase cascade—PARP-