晚期氧化蛋白產(chǎn)物對足細(xì)胞凋亡的影響及其機制的研究.pdf

1、研究證實AOPPs主要通過NAD（P）H氧化酶產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生ROS，促進(jìn)中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)升高，而足細(xì)胞存在NAD（P）H氧化酶的亞單元p22phox、Nox2、Nox4、p47phox和p67phox，因此推測AOPPs對于腎小球損傷可能主要定位于足細(xì)胞，并且可能通過NAD（P）H氧化酶產(chǎn)生ROS，后者作為第二信使，誘導(dǎo)了凋亡蛋白活化進(jìn)而促使了足細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生了蛋白尿，最終導(dǎo)致腎小球硬化和進(jìn)行性腎功能衰竭。本實

2、驗的目的旨在證明上述推論正確性，以闡明AOPPs對于腎臟損傷尤其是腎小球足細(xì)胞損傷的作用機理。 研究方法: 一.無內(nèi)毒素AOPPs修飾的大鼠（小鼠）血清白蛋白（AOPPs-RSA、AOPPs-MSA）的制備和鑒定： AOPPs-RSA/MSA的制備和鑒定采用Witko-Sarsat等介紹的方法。將無內(nèi)毒素的RSA/MSA溶液（100mg/ml）與200mmol/L次氯酸等體積混合，室溫放置30min，制備出RS

3、A/MSA與次氯酸摩爾比為1：140的AOPPs。制備的AOPPs-RSA/MSA在無內(nèi)毒素PBS中透析24小時，以除去游離的次氯酸。用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存。100mg/ml RSA/MSA與無菌PBS等體積混合，作為對照。AOPPs-RSA/MSA含量測定：以不同濃度氯胺T制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定酸性條件下340nm處吸光值。尿毒癥患者血清通過凝膠過濾預(yù)裝柱HiPrep16/60 Sephacryl S-300HR co

4、lumn分離獲得。制備的所有AOPPs-RSA/MSA用鱟試驗法測定內(nèi)毒素，并證實內(nèi)毒素水平低于0.025EU/ml。 二.小鼠足細(xì)胞系MPC5培養(yǎng) 按Mundel的方法。 分化培養(yǎng)液的配置：含10%FBS、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液； 增殖培養(yǎng)液：在上述培養(yǎng)液中再加入50u/ml重組小鼠IFN-γ。 增殖培養(yǎng)：細(xì)胞傳代培養(yǎng)于33℃含5%CO2培養(yǎng)箱，隔天

5、換液。 分化培養(yǎng)：誘導(dǎo)分化，足細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)液，37℃含5%CO2培養(yǎng)箱，使podocyte分化10-14天使用，隔天換液1次。待細(xì)胞分化后，使用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時。根據(jù)不同的實驗?zāi)康姆纸M，使用各種試劑和藥物刺激。本研究使用10-18代podocyte。 三.實驗動物處理 雄性正常SD大鼠80只，隨機分為8組，每組10只，作如下處理：（1）AOPPs-RSA100mg/kg體重，尾靜脈注射，每日一次；

6、（2）AOPPs-RSA100mg/kg體重，尾靜脈注射，apocynin100mg/kg體重，灌胃，均每日一次；（3）未經(jīng)修飾的RSA100mg/kg體重，尾靜脈注射，每日一次；（4）等體積生理鹽水，尾靜脈注射，每日一次。分別于注射5周和12周處死大鼠，處死前一天將大鼠置代謝籠留取24小時尿并測量鼠尾動脈壓。 四.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染及流式細(xì)胞檢測凋亡率 MPC5以1×106/孔種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)

7、胞貼壁后換無血清RPMI1640培養(yǎng)基24小時，使細(xì)胞同步于G0期，（1）以0，10，50，100，200，400μg/ml AOPPs刺激48小時，或以200μg/mlAOPPs刺激0，6，12，24，48，72小時；（2）抑制劑采用10～100μM DPI；25～200μM apocynin；10～50μM L-NMMA；25～100μM allopurinol；10～50μM indomethacin；2.5～250μM rote

8、none；10～50μM TTFA；10～50μM myxothiazol；10～200u/ml c-SOD；1μM Go6983提前于37℃預(yù)先孵育60min，后以200μg/ml AOPPs刺激48小時；（3）小鼠血清白蛋白刺激組采用200μg/ml未經(jīng)修飾的小鼠血清白蛋白刺激48小時。以AnnexinⅤ-FITC/PI雙染，流式細(xì)胞儀激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm檢測凋亡率。（4）AOPPs-F刺激組采用AOPPs-F

9、200μg/ml刺激48小時。 五.TUNEL-FITC/Hoechst33258熒光檢測凋亡 1.細(xì)胞：MPC5以106/孔種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中無菌蓋玻片上，細(xì)胞貼壁后換無血清RPMI1640培養(yǎng)基24小時，使細(xì)胞同步于G0期，以0，200μg/ml AOPPs刺激48小時，同時設(shè)200μg/ml AOPPs加100μM apocynin組，刺激結(jié)束，以0.01MPBS洗細(xì)胞爬片3次，TUNEL-FITC法染色凋亡細(xì)胞

10、，以Hoechst33258復(fù)染，熒光顯微鏡觀察FITC綠色熒光和Hoechst33258藍(lán)色熒光，立即拍照，存像。 2.尿沉渣脫落足細(xì)胞：無菌環(huán)境收集大鼠膀胱穿刺尿標(biāo)本，1500r/min，10min，以0.5ml0.01M PBS重懸后以細(xì)胞甩片機1500r/min，5min離心甩片，室溫干燥，4℃丙酮固定10min，滴加羊抗小鼠足突素（podocalyxin，PCX）一抗和TRITC標(biāo)記驢抗羊二抗，后加入TdT酶和FITC

11、-dUTP混合反應(yīng)液，Hoechst33258復(fù)染，熒光顯微鏡觀察TRITC紅色熒光，F(xiàn)ITC綠色熒光和Hoechst33258藍(lán)色熒光，立即拍照，存像。 六.TUNEL和WT-1雙色熒光標(biāo)記法檢測腎小球足細(xì)胞凋亡 8組大鼠腎臟皮質(zhì)組織冰凍切片4μm，丙酮固定，PBS洗3次，加入TdT酶和FITC-dUTP混合反應(yīng)液，后加入WT-1一抗，TRITC標(biāo)記二抗顯色，封片，熒光顯微鏡下計數(shù)TUNEL和WT-1雙陽性的凋亡足細(xì)胞

12、。 七.電鏡檢測細(xì)胞凋亡 1.細(xì)胞：MPC5以5×106種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以0，200μg/ml AOPPs-MSA刺激48小時，以200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA作為對照，同時設(shè)200μg/mlAOPPs-MSA加100μM apocynin組。刺激結(jié)束，以0.01MPBS洗細(xì)胞表面，收集細(xì)胞沉淀于2.5%戊二醛固定，4℃PBS漂洗，四氧化鋨二次固定，丙酮脫水，樹脂包埋，修塊，80nm超薄切片，醋酸鈉和檸檬鉛染

13、色，透射電鏡觀察。 2.組織：8組大鼠腎臟皮質(zhì)組織，于2.5%戊二醛固定，4℃PBS漂洗，四氧化鋨二次固定，丙酮脫水，樹脂包埋，修塊，80nm超薄切片，醋酸鈉和檸檬鉛染色，透射電鏡觀察。 八.Wetsern Blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白 MPC5以5×106種于25c㎡細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以0，200μg/ml AOPPs-MSA刺激2～48小時；抑制劑組采用10μM DPI，100u/ml c-SOD，1μM G

14、06983提前于37℃預(yù)先孵育60min，后以200μg/ml AOPPs刺激24小時。以200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA作為對照。刺激結(jié)束，以0.01MPBS洗細(xì)胞表面，收集細(xì)胞總蛋白檢測p53，Bax，Bcl-2，Procaspase3，Cleaved caspase3，和PARP-1表達(dá)。8組大鼠腎皮質(zhì)勻漿收集總蛋白，檢測p53，Bax，Bcl-2，Procaspase3，Cleaved caspase3，和PARP-1表達(dá)。

15、 九.體視學(xué)觀察腎小球足細(xì)胞數(shù)目、密度和腎小球體積 8組大鼠腎臟皮質(zhì)組織1mm3小塊，于2.5%戊二醛固定，樹脂包埋，修塊，1μm半薄切片，以第一張完整切片計數(shù)為0，每第19和20張保留于同一張切片，每只鼠至少保留10對切片，后以1%甲苯胺藍(lán)染色，計數(shù)腎小球體積足細(xì)胞數(shù)目。 十.免疫組織化學(xué)計數(shù)腎小球足細(xì)胞數(shù)目及進(jìn)行增殖抗原染色 8組大鼠腎臟皮質(zhì)組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm切片，Wilms'Tum

16、or1（WT-1）染色腎小球足細(xì)胞核，計數(shù)足細(xì)胞數(shù)目。同樣切片進(jìn)行增殖抗原Ki-67和PCNA染色，觀察足細(xì)胞是否增殖。 十一.化學(xué)發(fā)光檢測NADPH氧化酶活性 十二.NADPH氧化酶活化 結(jié)論: 我們的研究證實，AOPPs以時間和劑量的方式誘導(dǎo)了腎小球足細(xì)胞的凋亡，其途徑主要通過了PKC介導(dǎo)的NADPH氧化酶依賴的O2-途徑，p53、Bax蛋白參與AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞的凋亡，p53和Bax蛋白在NAD