活化蛋白C抑制足細(xì)胞凋亡的作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的：①研究aPC對PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響。㈡探索aPC抗足細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。③探討aPC和PAR-3下游信號(hào)通路在抗足細(xì)胞凋亡中的可能作用。
　　 方法：⑴用TUNEL凋亡試劑盒檢測不同濃度aPC對PAN誘導(dǎo)的人足細(xì)胞凋亡的影響,同時(shí)在封閉抗體及Aptamer的干預(yù)下檢測aPC抗凝血作用對足細(xì)胞凋亡的影響。⑵應(yīng)用RT-PCR，Western Blot,免疫熒光技術(shù)對足細(xì)胞相關(guān)基因(Thbd,PAR-1,PAR-2,PA

2、R-3,PAR-4,EPCR)表達(dá)譜及蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析。⑶運(yùn)用相關(guān)受體特異激動(dòng)劑及封閉抗體進(jìn)行干預(yù)，篩選出參與aPC影響足細(xì)胞凋亡關(guān)鍵受體，進(jìn)一步運(yùn)用shRNAmir gene Knock Down技術(shù)證實(shí)篩選關(guān)鍵受體的正確性。⑷在不同刺激下(aPC,TRAP-3,Thrombin)，用熒光顯微鏡持續(xù)記錄鈣敏感的熒光染料（Fura-2 AM)標(biāo)記的足細(xì)胞，檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化。⑸借助免疫共沉淀技術(shù)研究相關(guān)受體作用的時(shí)效性。⑹采用分

3、子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建表達(dá)V5指示蛋白標(biāo)記的野生型PAR-3載體，用定點(diǎn)突變試劑盒構(gòu)建PAR-3相關(guān)突變型載體并用其轉(zhuǎn)染腎小球系膜細(xì)胞系，建立相應(yīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系檢測aPC和PAR-3的相互作用以及對凋亡的影響。⑺運(yùn)用Western Blot，免疫共沉淀技術(shù)針對可能會(huì)參與aPC對凋亡調(diào)控的信號(hào)通路Caveolae，RhoA及ERK1/2等進(jìn)行相關(guān)活性檢測。
　　 結(jié)果：①aPC顯著降低了PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞的凋亡，即使在0.2nM這樣低的

4、濃度仍具有顯著的保護(hù)作用，此外利用封閉抗體HAAPC及Aptamer HSO2-88阻斷aPC的抗凝功能對上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著性影響。②體外培養(yǎng)的人足細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄層面極強(qiáng)表達(dá)PAR-2，PAR-3及Thbd，而PAR-1和PAR-4表達(dá)量極低，更有趣的是EPCR表達(dá)缺失，Western Blot數(shù)據(jù)從其翻譯的蛋白質(zhì)層面進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。此外健康人腎臟活檢冰凍切片雙標(biāo)免疫熒光檢測確證了在體足細(xì)胞表達(dá)PAR-2，PAR-3而無EPCR表

5、達(dá)。③從對PAR-1,PAR-2,PAR-3,PAR-4特異激動(dòng)劑及封閉抗體的研究中發(fā)現(xiàn)PAR-2及PAR-3是參與aPC影響足細(xì)胞凋亡關(guān)鍵受體，對采用shRNAmir gene Knock Down技術(shù)分別建立PAR-2及PAR-3Knock Down的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的研究中進(jìn)一步肯定了PAR-2及PAR-3是參與aPC影響足細(xì)胞凋亡關(guān)鍵受體。④在對足細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)aPC及PAR-3激動(dòng)劑無法誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，只有對照組

6、在Thrombin的誘導(dǎo)下于刺激后80秒左右產(chǎn)生一胞內(nèi)鈣離子峰值。⑤免疫共沉淀結(jié)果顯示PAR-2和PAR-3在aPC的刺激下形成異二聚體并呈時(shí)間依賴性，其聚合在刺激后10分鐘時(shí)開始增加，然后隨時(shí)間不斷增加。在PAR-3封閉抗體的干預(yù)下PAR-2和PAR-3在aPC的刺激下無法形成異二聚體。⑥RT-PCR結(jié)果顯示PAR-2，PAR-3及其突變載體轉(zhuǎn)染成功。aPC結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PAR-3及其突變體均可以同aPC結(jié)合。在對aPC刺激后收集

7、的細(xì)胞上清液的Western Blot分析過程中發(fā)現(xiàn)，在野生型和胞外段加TEM1穿膜及胞內(nèi)段的突變載體穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系上清中能檢測到V5指示蛋白，而在cleavage site突變載體穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系上清中沒能檢測到V5指示蛋白。轉(zhuǎn)染PAR-3野生型或其突變型載體的研究中發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜細(xì)胞只有轉(zhuǎn)染PAR-3野生型載體才能在aPC的刺激下對抗staurosporine或高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的凋亡。⑦免疫共沉淀結(jié)果顯示aPC刺激下調(diào)了Caveolin

8、-1和PAR-2及PAR-3的結(jié)合，在用M(β)CD破壞Caveolea 結(jié)構(gòu)后aPC失去其調(diào)節(jié)作用。Western Blot結(jié)果顯示磷酸化的Caveolin-1 同總的Caveolin-1的比值隨aPC的刺激時(shí)間增加而逐漸降低。此外aPC和PAR-2 激動(dòng)劑均無法抑制PAN誘導(dǎo)的Cavolin-1 gene Knock Down 穩(wěn)轉(zhuǎn)足細(xì)胞的凋亡。抑制Gαi，EGFR及 sphingosine receptor-1的活化對aPC的抗凋

9、亡作用無影響,然而抑制RhoA及MEK1 /MEK2的活化卻讓aPC抗凋亡作用消失。ERK1/2磷酸化及RhoA的活化均在aPC刺激10分鐘后顯著升高與Caveolin-1的去磷酸化過程一致。
　　 結(jié)論：⑴aPC有效降低PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡并獨(dú)立于其抗凝血功能。⑵人足細(xì)胞表達(dá)PAR-2和PAR-3，aPC能結(jié)合并裂解PAR-3，PAR-2和PAR-3及其異二聚體形成在aPC抗凋亡的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。⑶aPC抗凋亡作用需要Ca