鈣網(wǎng)織蛋白抑制TRAIL誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡的作用與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以慢性、進(jìn)行性、侵襲性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)，以關(guān)節(jié)滑膜炎及血管翳形成為主要病理特征的全身性自身免疫性疾病。其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。有研究報(bào)道稱鈣網(wǎng)織蛋白(CRT)可能與RA發(fā)病機(jī)制有關(guān)。本研究首先采用多種免疫學(xué)方法分析CRT在RA患者血清、滑液以及滑膜中的表達(dá);然后對血清CRT濃度與疾病活動(dòng)度DAS28、ESR和CRP的相關(guān)性進(jìn)行評估，同時(shí)檢測RF，anti-CCP，anti-MCV陽性和陰性

2、的RA患者血清中CRT的水平，分析CRT在RA患者體內(nèi)的情況;并進(jìn)一步通過構(gòu)建TRAIL誘導(dǎo)的JurkatT細(xì)胞凋亡模型，研究在體外CRT在Jurkat T細(xì)胞凋亡中的作用。本研究通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，探討CRT在TRAIL誘導(dǎo)的RAT細(xì)胞凋亡抵抗的發(fā)生機(jī)制，旨在研究CRT在RA發(fā)病機(jī)制尤其是炎癥反應(yīng)中的作用，為RA的診斷與治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分別檢測70例RA患者

3、，30例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，25例其他自身免疫病，20例骨性關(guān)節(jié)炎(OA)，35例健康對照(HC)血清中CRT的濃度;同時(shí)檢測了10例RA和16例OA患者關(guān)節(jié)液中CRT濃度。應(yīng)用Western blot分析RA、OA、SLE和正常對照血清樣本中CRT的含量及表達(dá)形式。
　　 2.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測RA和OA患者滑膜中CRT的表達(dá)。
　　 3.評估CRT的血清濃度與疾病活動(dòng)度DAS28、ESR和CRP的相關(guān)性。

4、并進(jìn)一步采用ELISA方法分別檢測RF，anti-CCP，anti-MCV陽性和陰性的RA病人血清中CRT的水平。
　　 4.采用ELISA分析CRT與TRAIL體外結(jié)合能力。
　　 5.采用細(xì)胞活力檢測試劑(Muse)檢測Jurkat T細(xì)胞活力，并用MTT的方法分析TRAIL對JurkatT細(xì)胞增殖的影響。
　　 6.運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)分析CRT抑制TRAIL誘導(dǎo)的早期凋亡的情況。
　　 結(jié)果:

5、　　 1.RA血清中CRT含量(4.817±2.425) ng/ml顯著高于OA(3.574±0.942ng/ml)和SLE組(4.013±1.536 ng/ml)，其他自身免疫病組(3.882±0.837 ng/ml)和健康對照組(3.726±0.627 ng/ml)，(P＜0.05)。RA滑液中CRT含量(3.700±0.220ng/ml)高于OA組(3.563±0.153 ng/ml)但無顯著差異(p=0.601)。Wester

6、n blot結(jié)果顯示RA、SLE、OA和HC血清樣品中均有CRT條帶;RA的CRT表達(dá)水平高于其他三組，且未見CRT的其它表達(dá)形式。
　　 2.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示CRT在RA關(guān)節(jié)滑膜高表達(dá)，主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及血管周圍。在OA組，CRT主要表達(dá)于關(guān)節(jié)滑膜的血管周圍和滑膜成纖維細(xì)胞。病理學(xué)結(jié)果提示，CRT在RA滑膜組織中明顯表達(dá)，與OA相比，CRT表達(dá)的位置和量均有明顯差異。
　　 3.RA

7、患者血清中CRT的濃度與DAS28、ESR和CRP正相關(guān)(R2=0.445.P＜0.0001;R2=0.567，P＜0.0001;R2=0.255.P＜0.0001)。RF陽性的RA患者血清CRT的濃度（5.152±0.467ng/ml）高于陰性的患者（4.157±0.603ng/ml），但是沒有顯著性差異(p=0.192)。anti-CCP和anti-MCV抗體陽性的患者血清CRT的濃度（5.387±0.468ng/ml和5.568±

8、0.510ng/ml）高于陰性的患者(2.928±0.143ng/ml和3.091±0.144ng/ml)，有顯著性差異(p=0.003，p=0.001)。
　　 4.ELISA分析CRT與TRAIL的體外結(jié)合能力，結(jié)果顯示，當(dāng)TRAIL分別為1μg/ml和2μg/ml時(shí)，CRT結(jié)合的百分率由115％提到了150％，CRT與TRAIL的結(jié)合呈劑量依賴關(guān)系。
　　 5.TRAIL對Jurkat T細(xì)胞增殖具有抑制作用。Ju

9、rkat T細(xì)胞分別加入50ng/ml和100ng/ml TRAIL。12個(gè)小時(shí)后，100ng/ml TRAIL處理的Jurkat T細(xì)胞顯示出對增殖的抑制作用，與對照組相比有顯著差異(P＜0.05)。作用24個(gè)小時(shí)50ng/ml和100ng/ml TRAIL都顯示出對Jurkat T細(xì)胞增殖的抑制作用，與對照組相比有顯著差異(P＜0.05)。
　　 6.CRT可以通過體外結(jié)合TRAIL抑制TRAIL誘導(dǎo)的早期凋亡。加入100n

10、g/ml TRAIL Jurkat T細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞數(shù)為31.07％。同時(shí)加入不同濃度的CRT(4、8和16ng/ml)與TRAIL共培養(yǎng)，早期凋亡的細(xì)胞數(shù)從29.5％，降低到24.34％，22.1％。
　　 結(jié)論:
　　 1.與其他自身免疫病與健康對照組相比，RA血清CRT的含量顯著增高，病理學(xué)結(jié)果顯示，CRT在RA滑膜組織中高表達(dá)，與OA組相比，CRT表達(dá)的位置和量均有明顯差異。結(jié)果提示CRT可能參與了RA的炎癥