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文檔簡介
1、目的:
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥及血管翳形成為主要病理特征的系統(tǒng)性自身免疫病。RA的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚,有研究報(bào)道鈣網(wǎng)織蛋白(Calreticulin,CRT)可能參與了RA滑膜炎癥的形成。本課題在前期研究基礎(chǔ)上,采用ELISA及免疫熒光的方法檢測了CRT及黏附分子在RA患者血清、滑液以及滑膜中的表達(dá),并分析血清、滑液中CRT與黏附分子含量的相關(guān)性;然后利用臍靜脈
2、內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型分析了CRT對黏附分子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制。通過研究CRT調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附作用進(jìn)而參與滑膜炎癥形成,從新的角度探討RA的病理機(jī)制,為RA的臨床診斷和治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
方法:
1.本研究所選取的患者標(biāo)本均來自2013年2月至2014年2月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院風(fēng)濕免疫科和天津醫(yī)院關(guān)節(jié)外科中心,其中血清標(biāo)本包括RA患者60例,女47例,男13例,年齡55~79歲。關(guān)節(jié)滑膜和滑液標(biāo)本:RA:10例,其中
3、女7例,男3例,年齡52~62歲;OA:14例,其中女10例,男4例,年齡56~69歲。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測RA血清和滑液中CRT及黏附分子的含量。
2.采用免疫組織熒光方法分析CRT和黏附分子在RA及OA滑膜中的定位。
3.分離培養(yǎng)原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,分析CRT對ICAM-1表達(dá)的影響。
4.免疫印跡(Western blot)檢測CRT對Akt及eNOS活化的影響,并分析PI3K及eN
4、OS抑制劑作用后ICAM-1的表達(dá)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS17.0軟件。計(jì)量資料以x±s表示,兩組間比較采用Student-Newman-Kenls檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。
結(jié)果:
1.可溶性 CRT在 RA患者血清及滑液中表達(dá)量為(5.359±2.27) ng/ml,(4.997±0.826) ng/ml;可溶性 ICAM-1以及 VCAM-1在血清中的含量分別為(485.772
5、±197.612) ng/ml,(419.609±188.338) ng/ml;在關(guān)節(jié)液中為(579.467±70.604) ng/ml和(511.368±101.39) ng/ml。分別分析 RA患者血清和滑液中 CRT與sICAM-1以及 CRT與 sVCAM-1含量的相關(guān)性。結(jié)果顯示,血清中 CRT與sICAM-1及與sVCAM-1均呈正相關(guān)(R2分別為0.612,0.554)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。關(guān)節(jié)液中CRT與sICAM-1及與
6、sVCAM-1也呈正相關(guān)(R2分別為0.710,0.405),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.免疫組織熒光結(jié)果顯示,與OA組相比,CRT及黏附分子ICAM-1,VCAM-1在RA滑膜組織的表達(dá)均增高;其中CRT在RA的滑膜襯里層和襯里下層,血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管周圍均有較強(qiáng)的表達(dá),而在 OA的襯里層和血管周圍有較弱的表達(dá)。結(jié)果顯示,CRT在兩組患者滑膜組織中的表達(dá)量和定位均存在顯著的差異。ICAM-1與 CRT共同表達(dá)在 RA滑膜組織的
7、血管內(nèi)皮細(xì)胞上,VCAM-1則主要定位在RA滑膜襯里層細(xì)胞。
3. CRT作用于內(nèi)皮細(xì)胞使黏附分子的表達(dá)上調(diào),且具有劑量依賴性。當(dāng)CRT濃度為5ng/ml時(shí),與空白對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(平均熒光強(qiáng)度MFI:(98.7±10.51)),當(dāng)濃度達(dá)到50n/ml及更高時(shí)ICAM-1的表達(dá)顯著升高。
4. CRT能夠促使內(nèi)皮細(xì)胞Akt的磷酸化,激活PI3K/Akt通路。PI3K/Akt被抑制時(shí),CRT活化的eNOS減少。PI3
8、K/Akt-eNOS通路被抑制劑后CRT誘導(dǎo)的ICAM-1的表達(dá)也明顯下調(diào)。
結(jié)論:
1. CRT及可溶性黏附分子sICAM-1、sVCAM-1在RA患者血清及滑液中的表達(dá)量均升高,且CRT與這兩種黏附分子在血清和關(guān)節(jié)液中的含量均呈正相關(guān)。
2. CRT與ICAM-1共同表達(dá)在RA滑膜血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管周圍;與VCAM-1則共定位于RA滑膜襯里層細(xì)胞。
3. CRT能夠上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表
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