類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制及肺間質(zhì)病變的相關(guān)研究.pdf

1、本研究分為四部分： 第一部分： 目的：研究細胞角蛋白在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的瓜氨酸化及其表達，探討細胞角蛋白在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的可能作用。 方法： 1.收集行外科手術(shù)的12例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織，28骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織，9例因外傷而行手術(shù)的正?；颊呋そM織，常規(guī)石蠟包埋和制備組織切片。 2.采用免疫組織化學(xué)分析、雙免疫熒光標(biāo)記分析、免疫沉淀和Western blot分析方法，檢測滑膜細胞膜是

2、否存在瓜氨酸化的細胞角蛋白，探討其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的作用。 (1)免疫組織化學(xué)分析：滑膜組織按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程去石蠟和再水化，組織切片經(jīng)蛋白水解酶消化預(yù)處理并用蒸餾水沖洗后，置PBS液中。然后組織切片與細胞抗角蛋白單克隆抗體AE1/AE3(Chemicon，USA)共同孵育。組織切片與第一個抗體4℃下孵育過夜，然后用PBS液洗去未反應(yīng)多余抗體。用UltraSensitiveTM S-P試劑盒行免疫組化檢測。 (2)

3、雙免疫熒光標(biāo)記分析：組織切片如前述方法處理，然后與單克隆的抗角蛋白抗體和兔的抗瓜氨酸化蛋白抗體4℃孵育12 h，在與抗MC孵育前，組織切片首先置于由試劑盒提供的修飾緩沖液中。在強酸環(huán)境中修飾蛋白的瓜氨酸殘基形成脲基加合物，它能確保檢出含有瓜氨酸的蛋白而對附近的氨基酸順序沒有影響。第二種抗體為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)和Cy<'TM>5標(biāo)記的羊抗兔lgG(H+L)(Zymed，USA)，分別作用于單克隆抗體和兔多克隆抗體。

4、組織切片室溫下孵育40 min，然后用熒光顯微鏡觀察。(Nikon 50i，Japan)。 (3)免疫沉淀和Western blot分析：利用總蛋白提取試劑盒(Biochain，USA)按照說明書對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(n=5)和骨關(guān)節(jié)炎(n=5)滑膜組織總蛋白進行純化。利用蛋白G免疫沉淀試劑盒對標(biāo)本蛋白質(zhì)中的角蛋白按照進行免疫沉淀。蛋白樣品(5ug)用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后利用Western blot儀轉(zhuǎn)至PVDF

5、膜上。 膜給予抗角蛋白或抗MC 抗體的探針標(biāo)記，并用ECL Westem Blotting參照說明進行檢測。免疫信號檢測采用Typhoon high performance gel and blot imager(Amersham)系統(tǒng)。 結(jié)論：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中存在瓜氨酸化的細胞角蛋白，細胞角蛋白在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中可能起重要作用。 第二部分： 目的：探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎肺間質(zhì)纖維化的臨床特點、肺部

6、HRCT、肺功能、動脈血分析的改變和血清細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和血小板源性生長因子-AB(PDGF-AB)的變化規(guī)律，討論其可能的發(fā)病機制。 方法：65例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人來自我院風(fēng)濕科門診和病房，30例RA合并肺纖維化，其中男3例，女27例，平均年齡48.2±12.6歲，病程4～18年，平均病程9.7±4.8年。；35例RA無肺纖維化，其中男4

7、例，女31例，平均年齡35.4±7.5歲，病程3～14，平均病程4.5±5.3年。實驗組病例均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)1987年RA分類標(biāo)準(zhǔn)。主要觀察指標(biāo)有性別、年齡、病程、收縮壓、舒張壓、呼吸次數(shù)，休息痛、病人評價、醫(yī)生評價，晨僵時間、握力、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)指數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)指數(shù)，關(guān)節(jié)功能評價，手X線分期，日常生活能力(HAQ)、肺部HRCT、肺功能、動脈血分析等。所有病人均空腹抽血5ml，分離血清，-70℃凍存，測定

8、其血清中血清細胞因子TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)、TNF-α(腫瘤壞死因子-α)、IGF-1(胰島素樣生長因子-1)和PDGF-AB(血小板源性生長因子-AB)濃度。 結(jié)論：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎肺間質(zhì)病變病人多項臨床活動指標(biāo)較類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎無肺間質(zhì)病變病人嚴重，肺部HRCT有明顯的小葉間隔增厚、葉間胸膜肥厚、胸壁胸膜肥厚粘連、支氣管壁增厚、蜂窩肺等影像學(xué)改變；肺功能檢查RA-ILD病人主要表現(xiàn)為彌散功能下降、限制性通氣障礙，阻塞性通

9、氣障礙、小氣道功能受損和混合性肺功能障礙；動脈血氣分析可有低氧血癥；血清細胞因子水平TGF-β1、TNF-α、IGF-1明顯增高(P<0.01)。 第三部分： 目的：利用百草枯誘導(dǎo)制備肺纖維化動物模型，觀察TGF-β1在肺纖維化過程中的動態(tài)變化規(guī)律，探討TGF-β1在肺纖維發(fā)病中的作用機制。 方法：健康雄性Wistar大鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分為對照組、染毒3天組、7天組、14天組和21天組，染毒組按5

10、0mg/kg劑量比配置百草枯懸液染毒，染毒組給予相應(yīng)劑量的百草枯溶液1ml灌胃，對照組同時給予1ml蒸餾水，實驗分3天、7天、14天和21天三個時間段進行觀察。2.各染毒組動物均于觀察結(jié)束后采用下腔靜脈穿刺取血約5ml，靜置20min，離心后取血清，-70℃冰箱凍存，待檢測，分離并結(jié)扎右肺支氣管，生理鹽水2ml灌洗左肺，連箱凍存。左肺灌洗后，肺組織置-70℃冰箱凍存，制備肺組織勻漿。取右肺，部分冰鹽水續(xù)3次，收集支氣管肺泡灌洗液(BAL

11、)，離心后取上清夜，與血清一起置于-70℃冰洗滌后置于由大連寶生物提供標(biāo)本存儲液中封存，待Real timequantitative PCR組織檢測。部分留取常規(guī)病理和電鏡標(biāo)本。死亡動物于頻死前采血采取上述措施留取標(biāo)本。血清、支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻漿TGF-β1的檢測參照senxiong公司試劑盒有關(guān)說明進行3.肺組織TGF-β1采用實時熒光PCR(Real Time quantitative PCR)方法按照試劑盒說明步驟進行。

12、 結(jié)論：百草枯誘導(dǎo)可建立典型的肺纖維化動物模型。轉(zhuǎn)化生長因子-β1在肺纖維化形成過程中明顯升高和持續(xù)表達，提示它在肺纖維發(fā)病機制中可能起到重要作用。 第四部分： 目的：探討Etanercept聯(lián)合甲基強的松龍對急性肺損傷的治療作用。 方法：健康雄性Wistar大鼠50只，隨機分為百草枯50mg/kg誘導(dǎo)組10只、百草枯50mg/kg誘導(dǎo)+甲強龍治療組10只，百草枯50mg/kg誘導(dǎo)+Etanercept治療

13、組10只，百草枯50mg/kg誘導(dǎo)+甲強龍+Etanercept治療組10只，正常對照組10只，21天處死，留取標(biāo)本即可。40只誘導(dǎo)大鼠全部于第1天灌胃誘導(dǎo)1次，誘導(dǎo)方法是將20％的百草枯除草劑用蒸餾水適當(dāng)稀釋至1ml,配制終濃度分別為50mg/kg的溶液灌胃，正常對照組同時給予1ml蒸餾水灌胃。治療組于誘導(dǎo)1小時候開始治療，方案為甲基強的松龍10mg/kg，稀釋后，鼠尾靜脈注射，一天一次，連用3d后改為5mg/kg，稀釋后鼠尾靜脈注射

14、，一天一次，用至第20天。腫瘤壞死因子拮抗劑0.5mg/kg，每周2次，皮下或肌肉注射，分別于誘導(dǎo)后第1d、4d、8d、11d、15d、18d給予。各組動物均于21d觀察結(jié)束后采用下腔靜脈穿刺取血約5ml，靜置20min，離心后取血清，-70℃冰箱凍存，待檢測，分離并結(jié)扎右肺支氣管，生理鹽水2ml灌洗左肺，連續(xù)3次，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，離心后取上清夜，與血清一起置于-70℃冰箱凍存。左肺灌洗后，肺組織置-70℃冰箱凍存，制

15、備肺組織勻漿。取右肺，部分冰鹽水洗滌后置于由大連寶生物提供標(biāo)本存儲液中封存，待Real time quantitative PCR組織檢測。部分留取常規(guī)病理和電鏡標(biāo)本。死亡動物于頻死前采血采取上述措施留取標(biāo)本。血清、BALF、肺組織勻漿中細胞因子TNF-α、TGF-β1的檢測參照senxiong公司試劑盒有關(guān)說明進行，美國R&D公司進口分裝。 結(jié)論：Etanercept聯(lián)合甲基強的松龍能明顯降低實驗動物血清、支氣管肺泡灌洗液和肺