赤芍801誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡研究.pdf

1、目的:探討赤芍801對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)凋亡的影響。
　　方法:RA患者關(guān)節(jié)滑液經(jīng)原代培養(yǎng)分離出FLS，取3-5代的RAFLS用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制。根據(jù)MTT結(jié)果，將細(xì)胞分為高劑量赤芍801組(64μg/ml)、低劑量赤芍801組(4μg/ml)和溶劑對(duì)照組，光學(xué)顯微鏡觀(guān)察其細(xì)胞形態(tài);An

2、nexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Fas/FaslmRNA相對(duì)表達(dá)量;細(xì)胞免疫化學(xué)方法對(duì)P65和P50表達(dá)定位進(jìn)行分析;提取核蛋白，采用免疫印跡方法檢測(cè)P65和P50表達(dá)。
　　結(jié)果:經(jīng)過(guò)反復(fù)貼壁與傳代以后，3～5代滑膜細(xì)胞逐漸純化，RA FLS在無(wú)赤芍801刺激下絕大多數(shù)為長(zhǎng)梭形，少量呈星形、多角形，胞質(zhì)透亮、均勻，核居中，排列具有局部方向性，低劑量赤芍801刺激24h后

3、無(wú)明顯改變，但高劑量赤芍801刺激后發(fā)生明顯改變:細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變成了不規(guī)則形或圓形，細(xì)胞密度明顯降低，體積縮小，核出現(xiàn)固縮，但胞膜和核膜完整。MTT結(jié)果顯示，赤芍801具有濃度依賴(lài)性的抑制RA FLS增殖功能，并在4μg/ml劑量下有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。流式結(jié)果表明，赤芍801具有誘導(dǎo)RAFLS凋亡功能，雖然低劑量組的凋亡率與對(duì)照組比較增加不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，但高劑量組的凋亡率較對(duì)照組顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜

4、0.05。逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)as mRNA在RAFLS中有表達(dá)，且有隨赤芍801濃度增加而表達(dá)增加趨勢(shì)，但Fasl mRNA在RA FLS中未被檢測(cè)出。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果指出，低劑量赤芍801刺激的RA FLS Fas mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組增加不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，但高劑量差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示，P65和P50蛋白在無(wú)赤芍801刺激作用下，主要在RA FLS細(xì)胞漿中被