穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯作用的研究.pdf

1、背景:
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)是一種自身免疫性疾病,病理上以滑膜增生和軟骨降解為特征,滑膜的前端以血管翳進(jìn)行性侵襲和破壞骨關(guān)節(jié),這種血管翳中主要由纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)組成,同時(shí)伴有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人中,這種纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的侵襲是破壞骨關(guān)節(jié)的主要因素。如果有辦法抑制纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的生長,則可

2、以對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的病情緩解起到一定的作用。
　　穿心蓮(Andrographis paniculata)是爵床科穿心蓮屬植物,穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide)是中藥穿心蓮的主要活性成分,它是一種二萜類內(nèi)酯類化合物,具有清熱解毒,涼血消腫的功效?；A(chǔ)研究和臨床領(lǐng)域的多項(xiàng)研究證明,穿心蓮內(nèi)酯有多種功效,如免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗炎、抗腫瘤、治療心腦血管疾病等。以往的研究中也有穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和降低細(xì)胞活性的報(bào)道,大型臨

3、床試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的癥狀緩解有一定的作用。但是,其具體的作用機(jī)制還不是十分清楚。因此,通過本實(shí)驗(yàn),探討穿心蓮內(nèi)酯對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的作用及其機(jī)制,以期為臨床用藥提供參考。
　　目的:
　　培養(yǎng)纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞,研究穿心蓮內(nèi)酯對纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的作用,并對其作用機(jī)制進(jìn)行研究。具體研究內(nèi)容包括:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞;
　　2.研究穿心蓮內(nèi)酯對滑膜細(xì)胞的誘導(dǎo)凋

4、亡作用及其機(jī)制;
　　3.研究穿心蓮內(nèi)酯對滑膜細(xì)胞的誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.從15位接受關(guān)節(jié)置換術(shù)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人中的關(guān)節(jié)滑膜中提取出纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞。15位病人隨即分為3個(gè)亞組,每一亞組中將提取出的滑膜組織混合在一起后再來提取細(xì)胞。首先將分離出的滑膜組織粉碎成直徑小于1mm的小顆粒,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后,在37度用1mg/mL的膠原酶1進(jìn)行溶解,震蕩2小時(shí)。反應(yīng)后的細(xì)胞懸液

5、用孔徑70um的細(xì)胞過濾網(wǎng)過濾,然后用細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)基為達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM),培養(yǎng)基中有10％的胎牛血清和抗生素(100U/mL青霉素,100mg/mL鏈霉素),,條件設(shè)置為37攝氏度、二氧化碳濃度為5％。細(xì)胞培養(yǎng)基每3天更換一次,細(xì)胞鋪滿后按1:3的比例傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)后的細(xì)胞與纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞形態(tài)一致,在顯微鏡下呈現(xiàn)出典型的雙極形狀。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中每個(gè)實(shí)驗(yàn)均做3次,每個(gè)亞組一次。
　　2.培養(yǎng)后的滑膜

6、細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中放置24小時(shí)后,用不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)分為四組:(1)空白對照組;(2)低濃度干預(yù)組,穿心蓮內(nèi)酯用藥濃度為10mM/L;(3)中濃度干預(yù)組,穿心蓮內(nèi)酯用藥濃度為20mM/L;(4)高濃度干預(yù)組,穿心蓮內(nèi)酯用藥濃度為30mM/L。在藥物干預(yù)48小時(shí)后,進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測。
　　3.檢測內(nèi)容
　　(1)MTT法測定細(xì)胞生存率。將細(xì)胞種植于96孔板中,每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)大約為10000個(gè),24小時(shí)后用

7、上述四組藥物進(jìn)行干預(yù)48小時(shí),然后每孔中加入20μL的PBS溶液,其中MTT濃度為5 mg/mL,37攝氏度下培育4小時(shí)。用二甲基亞砜充分溶解還原物后用酶聯(lián)檢測儀上測定光密度(OD)值,檢測波長540nm,參考波長690nm。
　　(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。將細(xì)胞種植于六孔板中,每孔中的細(xì)胞數(shù)量為2×105,用上述四組藥物進(jìn)行干預(yù),48小時(shí)后,收集細(xì)胞,碘化丙啶染色,流式細(xì)胞儀檢測 DNA含量。
　　(3)凋亡檢測。參照

8、說明書,用膜連蛋白異氰酸熒光素試劑盒進(jìn)行凋亡檢測。將細(xì)胞種植于6孔板中,每孔數(shù)量為2×105細(xì)胞,孵育24小時(shí)后,用上述四組不同濃度藥物干預(yù)48小時(shí)后,在暗房中用5μl膜連蛋白異氰酸熒光素和10μl碘化丙啶染色15分鐘,染色后馬上進(jìn)行檢測。早期的凋亡細(xì)胞用膜連蛋白異氰酸熒光素染色為陽性,碘化丙啶染色為陰性。
　　(4)在提取細(xì)胞前,先用1％的十二烷硫酸鈉,0.1mM/L苯甲磺?；锖偷鞍酌敢种苿⒓?xì)胞溶解,裂解物用離心機(jī)以13

9、000的轉(zhuǎn)速離心15分鐘,取上清以-80℃保存。提取細(xì)胞時(shí)先加入預(yù)冷的抽提試劑,抽提試劑中含有20mM/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸/氫氧化鉀(pH7.5),1.5mM/L氯化鎂,1mM/L EDTA,1mM/L二硫蘇糖醇,0.1mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)和蛋白酶抑制劑。然后,將裂解液以每分1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速離心分離細(xì)胞核和未破損的細(xì)胞。上清液在4℃條件下以每分13000轉(zhuǎn)速離心15分鐘。剩余的上清液保存在-80℃以備后續(xù)檢測。用布拉德福德

10、蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。
　　(5)蛋白印跡分析。包括制膠、預(yù)電泳、加樣、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、雜交、顯色和顯影定影等步驟。
　　(6)細(xì)胞凋亡蛋白酶3活性檢測。用凋亡蛋白酶3比色測定試劑盒,按照說明書進(jìn)行檢測。將細(xì)胞種植于6孔板中,每孔數(shù)量為2×105細(xì)胞,孵育24小時(shí)后,用上述四組不同濃度藥物進(jìn)行干預(yù)48小時(shí),加入含有50mM HEPES、0.1％CHAPS、1mM DTT、0.1mM EDTA和0.1％Triton X-

11、100的溶解劑。細(xì)胞裂解液在4℃下以12000轉(zhuǎn)每分轉(zhuǎn)速離心10分鐘,將Caspase-3顯色底物Ac-DEVD-pNA加入離心后的上清液中,在37攝氏度條件下孵育1小時(shí)。陰性對照組未加入顯色底物。通過測量吸光度(405nm)來檢測凋亡蛋白酶3活性。
　　結(jié)果:
　　1.穿心蓮內(nèi)酯可以抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的細(xì)胞增值并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。MTT結(jié)果說明穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)顯著抑制了滑膜細(xì)胞的增生;細(xì)胞周期檢測顯示S期和G

12、2/M期的細(xì)胞比例顯著下降,而G0/G1期的細(xì)胞比例上升。其中,在穿心蓮內(nèi)酯高劑量干預(yù)組中,G0/G1期的細(xì)胞增多接近30％,S和G2/M期的細(xì)胞下降達(dá)到50％。在藥物干預(yù)組中還發(fā)現(xiàn),細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子p21和p27表達(dá)水平升高,細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4水平下降。
　　2.穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。V/PI染色顯示凋亡細(xì)胞的數(shù)量呈劑量依賴性增多。免疫印跡法顯示凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)水平升高,B

13、cl-2表達(dá)水平下降。同對照組相比,藥物干預(yù)組的Bcl-2/Bax的比率顯著下降。
　　3.穿心蓮內(nèi)酯促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放和細(xì)胞凋亡蛋白酶3的激活。免疫印跡結(jié)果顯示藥物干預(yù)組的剪切后細(xì)胞凋亡蛋白酶3表達(dá)水平升高,且這種表達(dá)水平的升高具有濃度依賴性。熒光底物標(biāo)記的細(xì)胞凋亡蛋白酶3的水平也顯著升高。Western blot analysis顯示細(xì)胞色素c的表達(dá)水平也呈劑量依賴性的升高。
　　結(jié)論:
　　1.穿心蓮內(nèi)酯抑制類