人類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞-軟骨-SCID鼠嵌合體模型的研制.pdf

1、研究背景與目的:
　　 類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節(jié)滑膜炎癥導致軟骨侵蝕破壞為病理中心的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，臨床主要表現為對稱性、慢性、進行性多關節(jié)炎，并可累及多個臟器。關節(jié)滑膜的慢性炎癥、增生，形成血管翳，侵犯關節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，造成關節(jié)軟骨和骨的破壞，最終導致關節(jié)畸形和功能喪失。RA的發(fā)病率在我國約為0.4％，全球為0.5％～1.0％，多發(fā)于中青年，該病致殘率很高

2、，嚴重影響患者的工作和生存質量。但是RA的病因與發(fā)病機制至今尚未完全清楚。RA動物模型是研究RA病因和發(fā)病機制的最為有效的途徑之一。
　　 傳統(tǒng)的RA動物模型包括兩大類，一是誘導性關節(jié)炎如佐劑性關節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）、膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)等，一是自發(fā)性關節(jié)炎主要是指基因修飾關節(jié)炎小鼠，包括K/BXN小鼠、NZB/NZW小鼠。這些RA動物模型

3、雖可模擬出外周多關節(jié)的炎癥反應，表現出關節(jié)的紅腫、疼痛，病理變化也可表現出關節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕，關節(jié)腔內有炎癥細胞浸潤等特點，與人RA在臨床表現、病理、免疫有著相似或相近的特點。但是關節(jié)炎癥反應隨著注射點的不同炎癥局限，具有自限性，而且在血清中很難檢測到RF、CCP抗體、炎癥因子、基質金屬蛋白酶等RA血清學指標。自發(fā)性動物模型除上述外周關節(jié)炎癥表現外，雖可在血清中檢測出RF、CCP抗體、MMP3等指標，但是造價昂貴，臨床應用受限。由于R

4、A病因病機復雜且多變，這些模型只是側重于RA炎癥反應這一特點，僅僅反映出是由T、B細胞介導的炎癥反應這一過程，并沒有完全反應慢性持續(xù)性炎癥反應、滑膜炎癥并增生、關節(jié)侵蝕破壞等中心病理特征，因此這些具有一定的局限性，制約了對RA病因病機的研究。
　　 隨著對RA滑膜成纖維細胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblast，RASF)的深入研究，發(fā)現 RASF在 RA的發(fā)病中不在作為一個“旁觀者”

5、，而是一個“主動參與者”。在RA中，RASF一直處于慢性活化狀態(tài)，細胞本身出現一系列轉化特性，生長調控機制障礙，導致細胞出現“類腫瘤樣生長”，自身過度增殖，且不依賴于“T細胞介導”這一途徑就可分泌多種趨化因子、炎癥因子、MMP類、組織蛋白酶類，引起慢性持續(xù)性關節(jié)炎、關節(jié)軟骨侵蝕破壞，在RA滑膜增生，關節(jié)炎癥，軟骨的侵蝕破壞方面起著關鍵作用。
　　 上世紀90年代開始，Geiler首次將人RA滑膜組織與人正常軟骨聯合移植入SCID

6、小鼠的腎囊中，發(fā)現移植的滑膜出現增生，并侵蝕人的軟骨，在侵蝕處檢測到滑膜成纖維樣細胞增生活躍，大量表達基質降解酶的mRNA。成功建立一種新型的人源化動物模型—SCID—HuRAg鼠嵌合體模型。隨后造模方式、移植材料得到不斷的改進。移植物可以是滑膜組織，體外培養(yǎng)的滑膜細胞，也可以是關節(jié)液;移植方式可以是滑膜和軟骨共同移植，滑膜細胞和軟骨共同移植，也可以是單獨的滑膜細胞為移植物;移植部位多樣，可以是腎囊、腹腔、皮下、膝關節(jié)等。隨著SCID—

7、HuRAg鼠動物模型的建立和不斷的改進，不僅證實RASF的關鍵作用，完善了RA的發(fā)病機制，而且在藥理研究、新藥開發(fā)方面發(fā)揮了不可替代的作用。由于SCID—HuRAg鼠嵌合體模型能完全不受T、B細胞的影響，在無免疫炎癥的環(huán)境下，表現出的病變過程與人RA滑膜、軟骨病變過程幾乎一致，且可在血清中檢測到CCP抗體、IL-6、TNF-α等因子，成為RA動物模型的主流。
　　 但是在國內，對人源化的SCID—HuRAg鼠動物模型的研究起步很

8、晚，僅有報道將滑膜組織和人的正常軟骨植入SCID鼠的耳廓或皮下[8、9]，觀察到滑膜組織的增生和對軟骨的侵蝕破壞。而我國中藥資源豐富，為了更有效的篩選有效的中草藥，在吸取前人的經驗基礎上，我們將制作人類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞—軟骨—SCID鼠嵌合體模型，初步探討RASF在SCID鼠體內的作用機制，填補國內的空白。
　　 研究方法:
　　 （一）建立人RASF/OASF體外培養(yǎng)與鑒定
　　 1、采用兩種酶類（Ⅱ型

9、膠原酶和0.25％胰酶）聯合消化的方法，消化、分離培養(yǎng)、傳代、凍存人RASF/OASF，建立培養(yǎng)和保存體系。
　　 2、采用自然純化法和反復貼壁法純化滑膜成纖維細胞，用vimentin抗體和CD68抗體鑒定滑膜成纖維細胞。
　　 3、采用5—溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，5-Brdu)標記方法標記滑膜細胞。將濃度為10mmol/1的5-Brdu液經完全培養(yǎng)基稀釋后加入細胞培養(yǎng)瓶中，細胞培養(yǎng)液定

10、容至10ml，使5-Brdu的終濃度為10umol/1，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用鼠抗尿嘧啶脫氧核苷單克隆抗體鑒定細胞標記效果。
　　 （二）模型移植方法的建立
　　 1、移植細胞的選擇
　　 選擇第四代活力良好、經純化的、做好5-Brdu標記的滑膜成纖維細胞經消化、離心、重懸，細胞密度調整為2×105，做為移植細胞。
　　 2、人正常軟骨的選擇
　　 軟骨來源為一例因糖尿病壞疽行而行左踝關節(jié)截肢術的踝

11、關節(jié)軟骨，消毒、逐層分離皮膚、肌肉，暴露踝關節(jié)，剔除關節(jié)軟骨，將關節(jié)軟骨修剪成大小約0.5cm×0.5cm大小，在離體3h內植SCID鼠體內。
　　 3、無菌明膠海綿
　　 將無菌明膠海綿修飾成約0.8cm×0.8cm大小的小塊，備用。
　　 4、模型制作
　　 將SCID鼠隨機分為兩組，RASF組和OASF組，麻醉、備皮、消毒，在小鼠背部脊正中線外右側約1cm處做約1～1.5cm長的縱行切口，將修剪好的

12、軟骨小塊處入皮下，放平。同樣將修剪好的無菌明膠海綿置于軟骨面上，將500ul細胞液注入放置好的明膠海綿內，使海綿充分濕潤，縫合切口皮膚并消毒。RASF組注射細胞為RASF，OASF組注射細胞為OASF。
　　 （三）模型評價方法
　　 1、制作移植物石蠟H&E切片，觀察評價滑膜成纖維細胞對移植物軟骨的侵蝕降解程度，做出組織學評分，給予統(tǒng)計學處理。
　　 2、制作鼠雙膝關節(jié)石蠟 H&E切片，觀察鼠膝關節(jié)滑膜增生情況

13、和膝關節(jié)軟骨侵蝕破壞程度，做出組織學評分，給予統(tǒng)計學處理。
　　 3、免疫組織化學法檢測滑膜成纖維細胞5-Brdu抗體和vimentin抗體，觀察滑膜成纖維細胞在SCID鼠體內活動情況。
　　 4、利用IL-6、MMP3酶聯免疫吸附法試劑盒檢測兩組模型鼠血清中人IL-6、MMP3的含量。
　　 研究結果:
　　 （一）滑膜成纖維細胞的培養(yǎng)、鑒定、標記
　　 通過酶消化法，獲得大量的滑膜細胞，利用自

14、然純化發(fā)和反復貼壁法，在細胞傳代培養(yǎng)至第三時，行細胞形態(tài)鑒定，滑膜成纖維細胞呈vimentin陽性，CD68陰性，在熒光顯微鏡下觀察，滑膜成纖維細胞呈綠色熒光狀，細胞形態(tài)多樣，以紡錘形為主，細胞核呈卵圓形，位于細胞中央，核仁清楚。細胞呈渦狀生長，活力良好?；こ衫w維細胞的純化率高。檢測5-Brdu標記，在顯微鏡下觀察，標記好5-Brdu的滑膜成纖維細胞細胞核出現棕黃色著色，細胞標記率高。
　　 （二）模型鼠評價結果
　　

15、 1、移植物組織學評價
　　 鏡下觀察移植物內滑膜成纖維細胞在皮下和軟骨周圍存活并增生，侵蝕軟骨，侵蝕點多在軟骨邊緣，軟骨表面很少見到侵蝕點。軟骨邊緣的軟骨細胞介導周圍軟骨降解明顯，軟骨細胞形態(tài)發(fā)生改變，表現為軟骨細胞核周圍的暈輪空泡擴大，邊緣失去銳利且較毛糙不光整。RASF組移植物的軟骨侵蝕程度(0.643±0.690 vs0.333±0.500)和軟骨降解程度（2.286±0.756 vsl.667±1.000）較OASF組

16、有增高趨勢。
　　 2、膝關節(jié)組織學評價
　　 鏡下觀察小鼠膝關節(jié)滑膜有不同程度的增生，在鼠膝關節(jié)腔里也可看到增生的滑膜，有新生血管形成，有些血管與增生的滑膜細胞形成纖維結節(jié)。增生的滑膜可侵蝕軟骨，嚴重者可侵犯至骨質。RASF組鼠膝關節(jié)的滑膜增生程度(3.091±0.831 vs1.667±0.985 p＜0.01)和軟骨侵蝕程度（1.636±1.748 vs0.583±1.379 p＜0.05）均顯著高于OASF組。<

17、br>　　 3、滑膜成纖維細胞在鼠體內活動途徑
　　 免疫組化檢測發(fā)現在SCID鼠皮下、移植軟骨處、鼠膝關節(jié)滑膜及骨髓中檢測出Brdu及vimentin陽性的SFs，證實滑膜成纖維細胞可經血液循環(huán)進行長距離遷移。
　　 4、血清學指標評價
　　 我們僅在RASFs組鼠血清中檢測出一例人的IL-6，其含量為55pg/ml，OASFs組鼠血清未檢測出IL-6。而MMP3的血清含量OA組為(39.50±17.35)

18、pg/ml，在RASFs組僅有一只小鼠血清檢測出MMP3，含量為59 pg/ml。
　　 結論:
　　 1、成功建立人RASF和OASF體外培養(yǎng)和保存體系;
　　 2、成功建立人類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞—軟骨—SCID鼠嵌合體模型，初步探討滑膜成纖維細胞在SCID鼠體內的作用機制，即滑膜成纖維細胞在體內可分泌多種細胞因子，造成移植軟骨降解，并可經血液循環(huán)，遷移至鼠膝關節(jié)腔，引起膝關節(jié)滑膜炎癥，滑膜增生，關節(jié)軟骨