脂聯(lián)素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞遷移及侵襲特性影響的研究.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　大量研究證實血漿中含量最高的脂肪因子脂聯(lián)素(Adiponectin，AD)參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的發(fā)病過程。我們前期工作證實RA患者滑膜組織中AD及AdipoR1表達(dá)明顯高于正常人群;而關(guān)節(jié)局部高表達(dá)的脂聯(lián)素可加重膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠（Collagen-induced arthritis，CIA）的骨破壞，其機制尚不十分清楚。RA滑膜成纖維細(xì)胞(Rheumatoid art

2、hritis synovialfibroblasts，RASFs)與OA滑膜成纖維細(xì)胞或皮膚的成纖維細(xì)胞有著迥然不同的特性，表現(xiàn)為異常增生能力、介導(dǎo)炎癥稽留、遷移及侵襲等類腫瘤特性。其中，RASFs獨特的遷移和侵襲特性在RA骨侵蝕中起著至關(guān)重要的作用。因此本研究主要探討AD是否通過影響RASFs遷移性及侵襲性等類腫瘤生物學(xué)特性，介導(dǎo)RA炎癥及骨侵蝕病理過程。
　　1.AD對RASFs遷移及侵襲特性的影響
　　體內(nèi)實驗:構(gòu)建膠

3、原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型，小鼠關(guān)節(jié)局部注射脂聯(lián)素，觀察AD對CIA鼠關(guān)節(jié)炎癥及骨侵襲的影響。
　　體外實驗:細(xì)胞劃痕實驗及Transwell coming實驗觀察不同濃度AD(0、0.1、1和10μg/ml)與RASFs培養(yǎng)24h后對RASFs遷移的影響。用覆蓋明膠的Transwell corning實驗觀察不同濃度AD（0、0.1、1和10μg/ml）與RASFs培養(yǎng)24h后對RASFs的侵襲作用。將AD受體(Adipon

4、ectin receptors，AdipoRs)沉默后，觀察AD對RASFs的遷移及侵襲特性的影響是否依賴AdipoRs。
　　2.AD對RASFs基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2，9表達(dá)的影響
　　體內(nèi)實驗:觀察CIA小鼠關(guān)節(jié)局部滑膜組織中AD mRNA表達(dá)與MMP-2，MMP-9mRNA表達(dá)的相關(guān)性;觀察CIA小鼠關(guān)節(jié)局部注射AD后對關(guān)節(jié)組織中MMP-2，MMP-9表達(dá)的影響。
　　體外實驗:Real-time PCR方

5、法及Western blot方法檢測AD是對RASFs中MMP-2，MMP-9表達(dá)的影響。觀察沉默AdipoRs后，AD對RASFs中MMP-2，MMP-9表達(dá)的影響。
　　3.AD對RASFs內(nèi)PI3K/AKT信號通路的影響
　　PI3K/AKT信號通路與細(xì)胞遷移、粘附、血管生成及細(xì)胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)。用10μg/ml AD在不同時間點(0min、5min、10min、15min、30min、60min)刺激RASFs，

6、收取細(xì)胞，提蛋白，采用western blot方法檢測RASFs中PI3K、AKT磷酸化情況的變化。
　　實驗結(jié)果:
　　1.AD通過AdipoR1促進(jìn)RASFs遷移性及侵襲性
　　體內(nèi)實驗:與CIA組鼠相比，CIA小鼠關(guān)節(jié)局部注射AD后，滑膜炎癥、滑膜增生及骨侵蝕明顯增加。
　　體外實驗:AD(10μg/ml)組較空白組顯著促進(jìn)RASFs遷移通過Transwell小室微孔的數(shù)目（234.3±69.1Vs127.

7、3±42.5），且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);AdipoR1沉默后，RASFs遷移(137.3±14.3Vs94±0.9)及侵襲(151.9±28.6Vs108.3±26.3)通過Transwell小室微孔的數(shù)目明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。沉默AdipoR2，RASFs遷移數(shù)與未沉默組無明顯差異。
　　2.AD通過AdipoR1促進(jìn)RASFs中MMP-2，MMP-9表達(dá)
　　體內(nèi)實驗:CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜組織

8、中MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)較正常小鼠組明顯增加;且MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)與AD mRNA表達(dá)成正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為r=0.6723，0.4569，顯著性p＜0.05)。與未注射組相比，CIA組小鼠關(guān)節(jié)局部注射AD后，關(guān)節(jié)組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)明顯增高。
　　體外實驗: AD(10μg/ml)組較空白組顯著促進(jìn)RASFs表達(dá)MMP-2(12.11±4.28 Vs2.19±1.32,P＜0.05

9、)及MMP-9(26.12±13.74Vs2.80±2.30,P＜0.05).沉默AdipoRs后，AdipoR1干擾組較空白載體干擾組(Negative Control，NC)組MMP-2(1.78±0.48Vs4.27±2.45)，MMP-9(2.66±1.83Vs11.25±7.88)表達(dá)顯著下降且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。AdipoR2干擾組較空白載體干擾組MMP-2（4.14±2.17 Vs4.27±4.25），MMP-

10、9（5.26±2.80Vs11.25±7.88）表達(dá)下調(diào)，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.AD對RASFs內(nèi)PI3K/AKT信號通路
　　AD刺激RASFs30min后，胞內(nèi)PI3K在開始進(jìn)行磷酸化持續(xù)至60min。其中，AKT308位點在15min開始磷酸化，30min達(dá)到磷酸化高峰;473位點在30min開始進(jìn)行磷酸化持續(xù)至60min。
　　實驗結(jié)論:
　　1.AD可促進(jìn)RASF遷移及侵襲特性，可能是其加重RA