人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜—軟骨—NOD-SCID鼠嵌合體模型的制作研究.pdf

1、研究背景與目的：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為病理中心的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，全世界發(fā)病率約0.4％。目前發(fā)病原因仍不明確，亦無(wú)特效的治療措施。由于缺乏敏感、特異性的早期實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，現(xiàn)行的診斷主要依靠臨床癥狀及輔助檢查，當(dāng)患者被確診時(shí)，往往已出現(xiàn)不可逆性關(guān)節(jié)損傷。建立與RA發(fā)病機(jī)制及病理相同或相似的動(dòng)物模型在RA研究中的作用也就越來(lái)越重要了。 目前國(guó)內(nèi)RA動(dòng)物模型主要是誘導(dǎo)性炎癥模型，如膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA

2、)和佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)和自發(fā)性炎癥模型(CJ鼠)，主要從風(fēng)、寒、濕、熱、腎虛等“痹癥”角度模擬造模，而未能與病癥緊密結(jié)合；它們的滑膜增生都是受免疫炎癥反應(yīng)驅(qū)動(dòng)，并不能體現(xiàn)RA滑膜自身增生和侵蝕，與RA實(shí)際發(fā)病過(guò)程仍存在較大的距離。因此，上世紀(jì)90年代中期開始，將．RA滑膜移植到免疫缺陷動(dòng)物身上構(gòu)建免疫缺陷動(dòng)物/人RA移植物嵌合體模型的研究工作迅速得到重視。該模型在RA滑膜增生的病理機(jī)制，特別是篩選以抑制滑膜增生和軟骨侵蝕為目標(biāo)的藥物或

3、治療方法中得到廣泛應(yīng)用。而國(guó)內(nèi)對(duì)該模型的研制工作才剛開始起步，免疫缺陷動(dòng)物主要有裸鼠，T、B細(xì)胞功能缺陷的聯(lián)合重度免疫缺陷鼠(SCID)和T、B、NK細(xì)胞三缺陷的NOD/SCID和BNX鼠。目前廣泛應(yīng)用的是SCID鼠，NOD/SCID鼠能否作為RA滑膜移植物的載體尚未見(jiàn)報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)建立的NOD/SCID鼠-人RA移植物嵌合體模型，目的使RA滑膜組織在NOD/SCID鼠體內(nèi)形成新的自身免疫性反應(yīng)，于人體外模擬復(fù)制出RA的人源化動(dòng)

4、物模型，同時(shí)對(duì)RA發(fā)病進(jìn)程有重要意義的指標(biāo)進(jìn)行研究探討。為我國(guó)深入的研究RA提供新的動(dòng)物模型，尤其為阻止滑膜增生及軟骨侵蝕從中醫(yī)藥角度研究RA搭建平臺(tái)。 方法： (1)模型的建立：將20只NOD/SCID鼠隨機(jī)分為2組，各組10只，雌雄不限。RA模型組：用3％戊巴比妥鈉腹腔注射(0.2ml/100g)麻醉后，在鼠背部縱行切開(0.8～1.2cm)小口，將修剪好的正常軟骨(0.5～0.8cm)植于皮下，再將RA患者滑膜置于

5、軟骨之上縫合，術(shù)后切口常規(guī)消毒，200ml飲水瓶中加入諾氟沙星(8m咖1)抗生素溶液2ml，一周后拆線。OA模型組：同樣方法建立NOD/SCID鼠-人骨關(guān)節(jié)炎移植物嵌合體模型進(jìn)行比較。模型鼠術(shù)后與術(shù)前均在SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料，并保證每日攝食量相當(dāng)，飲水不限。室溫22±2℃，濕度保持60％，每周換墊料一次。 (2)血清TNF-a含量檢測(cè)：10周后，摘眼球法收集模型鼠血液，以3000r/min離心20min，血清于低溫環(huán)境

6、保存。在液相試劑盒中將<'125>I-FNF、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)緩沖液溶解后，精密吸取濃度(0.3，0.9，2.7，8.1，24.3ng/ml)的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本各100μl置5ml離心管中。并設(shè)T管(總計(jì)數(shù)管)和NSB管(非特異性結(jié)合管)，向T管加入100μl的標(biāo)記抗原，NSB管加入100μl標(biāo)記抗原和100μl注射用水后，樣品管分別加入標(biāo)記抗原100μl和抗體100μl充分混勻，置4℃冰箱。24h后取出，除T管外，各管分別加入分離劑500μ

7、l，充分混勻。室溫下靜置15min后，以3500r/min離心20min后棄上清液，在放射免疫γ計(jì)數(shù)器上檢測(cè)出樣品的TNF-a含量。 (3)組織病理學(xué)檢測(cè)：頸椎脫臼法處死模型鼠，用組織剪和手術(shù)刀將移植物剝離。經(jīng)4％多聚甲醛固定8h，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)脫鈣，酒精梯度脫水、二甲苯梯度透明，浸蠟包埋，切成厚度4μl切片貼于防脫硅化玻片上，烘干后備用。病理檢測(cè)指標(biāo)與步驟：①HE染色：經(jīng)脫蠟、酒精梯度脫水、水洗、HE染色、脫水和

8、封片固定后，在顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察；并對(duì)滑膜增生、軟骨侵蝕和軟骨降解進(jìn)行評(píng)分；②VEGF。原位雜交法檢測(cè)：脫蠟的切片經(jīng)后固定、預(yù)雜交、標(biāo)記探針雜交、洗滌、封閉、加抗體、DAB顯色以及蘇木素復(fù)染封片等步驟完成，在顯微鏡下觀察特異性陽(yáng)性表達(dá)；③TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：切片在脫蠟的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)37℃胰蛋白酶消化30min、加酶標(biāo)抗體后37℃孵育60min、DAB顯色劑以及蘇木素復(fù)染封片等步驟完成實(shí)驗(yàn)的操作。細(xì)胞凋亡片經(jīng)自動(dòng)圖象分析，提取反映

9、陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)弱的平均光密度值(MIOD)和陽(yáng)性信號(hào)多少平均著色面積(MSA)作半定量分析。(4)統(tǒng)計(jì)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x+s)形式表達(dá)，模型鼠血清TNF-a放射含量和切片細(xì)胞凋亡半定量分析數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，滑膜細(xì)胞增生程度、軟骨侵蝕程度和軟骨降解程度分析進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，P≤0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： (1)模型鼠一般情況：實(shí)驗(yàn)期間NOD/SCID

10、鼠無(wú)手摸皮骨感、活動(dòng)度差、毛稀疏等典型移植物抗宿主病的表現(xiàn)，模型鼠在SPF環(huán)境下10周存活率100％。 (2)TNF-a含量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果：RA滑膜組與OA滑膜組血清中TNF-a含量分別為0.80±0.06、0.70±0.03，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異(P<0.001)。 (3)組織病理學(xué)觀察：①HE染色：在顯微鏡下OA滑膜組只見(jiàn)少量的滑膜細(xì)胞增生和炎癥細(xì)胞，移植的滑膜組織主要被纖維組織形成的條索狀物代替，無(wú)明顯地軟骨被侵蝕

11、破壞發(fā)生；在RA滑膜組可明顯見(jiàn)到大量的滑膜細(xì)胞增生和生化中心形成，病變部位的組織結(jié)構(gòu)間質(zhì)變?yōu)槭杷桑瑸榫辰绮磺逦念w粒狀或塊狀無(wú)結(jié)構(gòu)強(qiáng)嗜酸性紅染物質(zhì)；軟骨邊緣被滑膜組織侵蝕破壞明顯；OA滑膜組與RA滑膜組炎癥積分評(píng)價(jià)分別為：滑膜增生(1.50±0.51 vs 2.56±1.15)、軟骨侵蝕(1.15±0.51 vs 2.42±1.29)和軟骨降解(1.50±0.51 vs 2.44±1.04)。兩組間差異均達(dá)到顯著水平(P≤0.040)。

12、②VEGF:鏡下OA滑膜組在切片中很少見(jiàn)到細(xì)胞胞漿VEGF mRNA的陽(yáng)性表達(dá)；而在RA滑膜組的切片中能清楚見(jiàn)到VEGF mRNA的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色的陽(yáng)性表達(dá)。③細(xì)胞凋亡：鏡下OA滑膜組可明顯見(jiàn)到細(xì)胞核被染成棕黃色顆粒即細(xì)胞凋亡，RA滑膜組細(xì)胞凋亡不明顯。OA滑膜組與RA滑膜組細(xì)胞凋亡半定量分析結(jié)果分別為：(OD：959.23±80.89vs 168.37±12.87)、(Area：1890.51±159.14 vs 180.21±

13、8.25)，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 結(jié)論： 用重度聯(lián)合免疫缺陷的NOD/SCID鼠為載體，可成功建立人RA滑膜-軟骨-NOD/SCID鼠嵌合體動(dòng)物模型。對(duì)模型的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，NOD/SCID鼠一次性接受組織移植后，通過(guò)10周的飼養(yǎng)，移植的人RA滑膜繼續(xù)保持增生和侵蝕能力，且繼續(xù)高表達(dá)TNF-a和VEGF，而細(xì)胞凋亡則明顯受抑。該模型在體外模擬復(fù)制出了自身免疫狀態(tài)下RA滑膜細(xì)胞增生到軟骨破壞的