Ezrin-Radixin-Moesin蛋白在類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達及其對成纖維樣滑膜細胞增殖的影響.pdf

1、研究背景：
　　 類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，主要侵犯外周關(guān)節(jié)，病理表現(xiàn)為滑膜增生、炎性細胞浸潤、血管翳形成，軟骨及骨組織侵蝕性破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、畸形和功能喪失。其發(fā)病機制目前尚未完全清楚，至今仍無根治方法。研究表明類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)通過非炎癥因

2、素依賴的“內(nèi)源性”通路及炎癥因素介導(dǎo)的“外源性”通路活化后其細胞性質(zhì)發(fā)生改變，如上調(diào)粘附分子、整合素表達，激活轉(zhuǎn)錄因子，分泌產(chǎn)生多種炎性細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、組織蛋白酶等有害因素，從而導(dǎo)致軟骨和骨的破壞，在RA的發(fā)病機制中扮演著極為重要的角色。
　　 ERM蛋白包括三個密切相關(guān)的成員：ezrin，moesin和radixin，屬于蛋白4.1超家族成員，最早作為細胞骨架蛋白和細胞膜的連接者被發(fā)現(xiàn)，已發(fā)現(xiàn)在多種細胞和組織中表達，

3、其分布有物種特異性和組織細胞特異性。近年研究表明，ERM除了作為細胞骨架蛋白和細胞膜的連接者外，還具有豐富的生物學(xué)功能，參與細胞變形、滲透性改變、增殖、遷移以及凋亡的過程及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 研究表明，RA FLS具有其他成纖維細胞不具備的特性，其細胞內(nèi)存在多種與細胞增殖和凋亡有關(guān)的基因變異，類似于腫瘤細胞。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)RAFLS存在明顯的細胞骨架重排現(xiàn)象，有學(xué)者認為此種現(xiàn)象可能參與RA的發(fā)病機制，而細胞增殖和凋亡與細胞骨

4、架重排、變構(gòu)密切相關(guān)。掘此，我們推測，作為細胞骨架與細胞膜的連接者，ERM蛋白可能參與了RA FLS的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為，但目前尚未見這方面的文獻報道。為此，本文擬通過觀察ERM及其磷酸化蛋白在RA滑膜組織中的表達，研究其是否參與調(diào)控FLS增殖和凋亡的生物學(xué)行為，并探討該過程中可能涉及的信號機制來闡明ERM及其磷酸化蛋白在RA發(fā)病中的作用，以期為RA發(fā)病機制的研究和治療提供新的思路。
　　 第一部分 ERM在RA滑膜組

5、織和成纖維樣滑膜細胞中的表達
　　 目的:觀察ERM及其磷酸化蛋白在RA滑膜組織和FLS中的表達。
　　 方法:取符合美國風濕病學(xué)會類風濕關(guān)節(jié)炎診斷標準的RA患者行關(guān)節(jié)鏡下滑膜切除術(shù)所得的滑膜組織、符合美國風濕病學(xué)會骨關(guān)節(jié)炎診斷標準的OA患者行關(guān)節(jié)置換術(shù)所得的滑膜組織、因外傷行關(guān)節(jié)修復(fù)術(shù)所得的正常人滑膜組織做細胞培養(yǎng)和石蠟切片，用組織免疫熒光、組織化學(xué)、免疫印跡等方法觀察ERM及其磷酸化蛋白在滑膜組織和FLS中的表達，并

6、觀察TNF-α、IL-1β等炎癥因子刺激對RAFLS磷酸化ERM蛋白表達的影響。
　　 結(jié)果:
　　 ERM三種蛋白在滑膜組織中均有表達，其中在RA滑膜組織中以ezrin最豐富，moesin次之，rαdixin最少；在OA滑膜組織中同樣以ezrin表達為主，moesin次之，未見radixin表達；在正常人滑膜組織中ezrin的表達也較豐富。在滑膜組織中，ERM蛋白主要集中分布于襯里層，但襯里下層也有少量分布，在RA滑膜

7、組織中尤為明顯，主要見于浸潤其中的單個核細胞。另外還可以觀察到，在滑膜襯里下層的血管內(nèi)皮細胞表達較多radixin和ezrin，不表達moesin。在RA、OA和正常對照組滑膜組織均可觀察到磷酸化ERM的表達信號，其分布類似于ERM蛋白。與正常人和OA患者相比，RA患者滑膜組織的ERM及其磷酸化蛋白表達明顯增多。
　　 在體外培養(yǎng)的RA FLS中，可以觀察到ERM蛋白的表達同樣以ezrin最豐富，moesin次之，radixin

8、最少。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，F(xiàn)LS表達少量磷酸化ERM蛋白，而炎癥因子TNF-α、IL-1β呈劑量依賴性地明顯上調(diào)磷酸化ERM蛋白表達，并且在相同濃度和時間的TNF-α刺激下，RA FLS的磷酸化ERM蛋白表達量明顯多于OA FLS和正常對照組。細胞免疫熒光顯示TNF-α除能上調(diào)磷酸化ERM表達外，還影響其在細胞中的分布，刺激后磷酸化ERM主要分布在細胞膜，而基礎(chǔ)狀態(tài)下則主要分布在細胞漿中。
　　 結(jié)論:ERM三種蛋白在人滑膜組織和成纖

9、維樣滑膜細胞中均有表達，其中以ezrin表達最豐富。與正常人和OA患者相比，RA患者滑膜組織和FLS中磷酸化ERM蛋白表達顯著增多，并且炎癥因子TNF-α、IL-1β等能顯著誘導(dǎo)RA FLS磷酸化ERM蛋白的表達，提示ERM蛋白可能參與RA滑膜炎的發(fā)病機制。
　　 第二部分RA成纖維樣滑膜細胞ERM磷酸化的信號調(diào)控機制研究
　　 目的:研究TNF-α誘導(dǎo)下RA FLS ERM磷酸化的信號調(diào)控機制。
　　 方法:取

10、培養(yǎng)至3～5代并經(jīng)過鑒定的RA FLS，將其分成對照組、PKC特異性抑制劑bisindolylmaleimideⅠ組、PKC特異性抑制劑R(o)-31-7549組、ROCK特異性抑制劑Y27632組、p38MAPK特異性抑制劑SB203580組，TNF-α組、TNF-α+bisindolylmaleimideⅠ組、TNF-α+R(o)-31-7549組、TNF-α+Y27632組、TNF-α+SB203580組，用免疫印跡法檢測各組中磷

11、酸化ERM和ERM的表達。
　　 結(jié)果:p38MAPK特異性抑制劑SB203580、PKC特異性抑制劑R(o)-31-7549、ROCK特異性抑制劑Y27632均能有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的ERM磷酸化，而PKC抑制劑bisindolylmaleimideⅠ則無此作用。此外，上述各種抑制劑對ERM蛋白表達沒有影響。
　　 結(jié)論:p38MAPK、PKC、Rho等信號通路均參與調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的RA FLS ERM磷酸化。<

12、br>　　 第三部分ERM siRNA的構(gòu)建及其對RA FLS增殖和凋亡的影響
　　 目的:構(gòu)建ERM siRNA，檢測其對RA FLS磷酸化ERM表達的影響，并探討其是否參與調(diào)控RA FLS增殖和凋亡過程及該過程可能涉及的信號調(diào)控機制。
　　 方法:設(shè)計針對ezrin、radixin、moesin的引物，將其與載體連接構(gòu)建干擾RNA(siRNA)，轉(zhuǎn)入細菌中進行擴增。用Lipofectein2000將siRNA轉(zhuǎn)入細

13、胞中，用RT-QPCR和Western blot法觀察其干擾效果，挑選出干擾效果最佳的siRNA轉(zhuǎn)染細胞。用Western blot法觀察ERM siRNA對FLS ERM及磷酸化ERM表達的影響，MTT法及流式細胞法檢測其對成纖維樣滑膜細胞增殖和凋亡的影響，最后用MTT、Western blot及細胞免疫熒光法研究磷酸化ERM蛋白調(diào)控細胞增殖可能涉及的信號通路。
　　 結(jié)果：
　　 所構(gòu)建的ezrin、radixin、

14、moesin siRNA可以有效地抑制RA FLS ERM及磷酸化ERM蛋白表達。同時，RA FLS的增殖能力及抗凋亡能力均受到顯著抑制，且磷酸化Akt表達及F-actin聚集亦受到明顯抑制。PI3K/Akt抑制劑LY294002顯著抑制F-actin聚集。
　　 結(jié)論:磷酸化ERM蛋白能促進類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞增殖，并且抑制其凋亡，該過程可能是通過激活磷酸化Akt和促進F-actin聚集實現(xiàn)的，提示通過抑制ERM磷酸化