槲皮素對人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分槲皮素對人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響
　　目的：
　　槲皮素（Quercetin）是一種天然的黃酮類化合物，具有抗炎和抗腫瘤的作用。本部分重點(diǎn)研究槲皮素對人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（ Rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes, RAFLSs）凋亡（Apoptosis）的影響。為槲皮素治療RA提供相關(guān)的理論依據(jù)。
　　方法：
　　

2、39例新鮮的RA滑膜組織取材于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科因RA行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者。RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合美國風(fēng)濕病學(xué)協(xié)會(huì)（ACR）修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。RA病人的關(guān)節(jié)滑膜組織采用胰蛋白酶消化法分離類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜細(xì)胞。用光學(xué)顯微鏡（Light microscope）觀察細(xì)胞的形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry, FCM）分析體外培養(yǎng)的RAFLSs表面標(biāo)記的白細(xì)胞分化抗原3（Cluster of differentiation

3、3，CD3）、CD19、CD14、以及CD90的表達(dá)情況。選用不同濃度的槲皮素（0,100,200,300μm）處理RAFLSs24小時(shí)。利用DNA片段化(DNA fragmentation assay)凋亡檢測法檢測槲皮素處理對RAFLSs凋亡率的影響。利用蛋白質(zhì)印跡法（ Western blot）檢測槲皮素對RAFLSs中凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶-3(Caspase-3;激活型)和半胱氨酸天冬氨酸酶 Caspase-9;激活型

4、)的影響。并通過比較目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度比值研究槲皮素對RAFLSs中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。同時(shí)利用試劑盒檢測Caspase-3和Caspase-9酶的活性。并計(jì)算不同槲皮素處理的RAFLSs中Caspase-3或者Caspase-9酶的活性與未處理組中對應(yīng)的Caspase-3或者Caspase-9酶的活性的比值，研究槲皮素對RAFLSs中Caspase-3和Caspase-9酶活性的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)以羅丹明

5、123（Rhodamine123）為熒光指示劑檢測各種濃度槲皮素處理的RAFLSs中線粒體跨膜電位的變化（△ψm）情況，分析槲皮素對RAFLS線粒體跨膜電位的影響。Western blot法檢測RAFLS細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C（Cytochrome C, cyt C）的表達(dá)情況，通過計(jì)算與比較Cyt C/β-actin灰度比值分析槲皮素對RAFLS細(xì)胞質(zhì)中Cyt C表達(dá)的影響。同時(shí)利用Western blot法檢測槲皮素對RAFLSs中促凋

6、亡蛋白Bax（Bcl-2 associated X protein，Bax）和抗凋亡蛋白Bcl-2（ B- cell lymphoma2, Bcl-2）的影響，并通過灰度分析，計(jì)算比較槲皮素對Bax/Bcl-2比值的影響。
　　結(jié)果：
　　分離出的RAFLS中CD90表達(dá)的陽性率大于95％，CD14表達(dá)的陽性率小于2%，CD19表達(dá)的陽性率小于1%，CD3表達(dá)的陽性率小于1%。相差顯微鏡下可以看到 RAFLSs貼壁生長，形態(tài)

7、均一，呈長梭形，折光性強(qiáng)，兩極胞突細(xì)長，末端多與鄰近細(xì)胞交織成網(wǎng)狀，RAFLSs核位于細(xì)胞中央，呈橢圓形，胞漿透亮，局部排列呈極向性。與未經(jīng)槲皮素處理的對照組相比，槲皮素處理的RAFLS的凋亡率顯著增加，而且成劑量依賴關(guān)系。槲皮素能夠明顯的促進(jìn)激活型caspase-3和caspase-9的表達(dá)，而且增強(qiáng)兩者的活性。槲皮素還能夠顯著降低RAFLSs中線粒體的跨膜電位,而且呈劑量依賴關(guān)系。與未經(jīng)槲皮素處理的RAFLSs相比，在槲皮素處理的R

8、AFLS細(xì)胞質(zhì)中Cyt C的表達(dá)也也顯著增強(qiáng)， Bax/Bcl-2的比值顯著升高。
　　結(jié)論：
　　槲皮素能夠促進(jìn) RAFLSs的凋亡，這可能與其促進(jìn) RAFLSs中激活型Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達(dá)并增強(qiáng)其活性，降低RAFLS線粒體跨膜電位，增加RAFLS細(xì)胞質(zhì)中Cyt C的表達(dá)，以及增強(qiáng)RAFLSs中促凋亡蛋白Bax/凋亡蛋白Bcl-2的比值有關(guān)。
　　第二部分 p53在槲皮素誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕性關(guān)

9、節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡中的作用
　　目的：
　　p53是腫瘤抑制因子，在細(xì)胞凋亡過程中起著重要的作用。本部分重點(diǎn)研究p53在槲皮素誘導(dǎo)的RAFLS細(xì)胞凋亡過程中的作用，為理解槲皮素誘導(dǎo)RAFLS細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　用不同濃度的槲皮素（0,100,200和300μm）處理 RAFLSs24小時(shí)。利用Western blot法檢測槲皮素對RAFLSs中p53蛋白磷酸化水平，并通過計(jì)算磷酸化

10、的 p53蛋白/內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度比值來研究槲皮素對 RAFLSs中 p53蛋白磷酸化水平的影響。用不同濃度（0,10,20和30μm）的 p53抑制劑pifithrin-alpha(PFT-α)預(yù)先處理RAFLSs30分鐘，然后再用200μm的槲皮素處理RAFLSs24小時(shí)。收集受到不同處理的RAFLSs，利用Western blot法檢測不同濃度 PFT-α對槲皮素介導(dǎo)的 p53磷酸化水平增強(qiáng)的影響。應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體（

11、 Cationic lipopolyamines）轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染對照小干擾 RNA(Small interfering RNA,siRNA)或p53特異siRNA至RAFLSs中。轉(zhuǎn)染后4小時(shí)，用新鮮培養(yǎng)基替換 RAFLSs中的轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)基。然后，經(jīng)過不同濃度的槲皮素（0,100,200和300μm）處理RAFLSs24小時(shí)后，利用Western blot檢測總的p53蛋白的表達(dá)水平；應(yīng)用DNA片段化法檢測RAFLSs的凋亡率。

12、　　結(jié)果：
　　Western blot法顯示槲皮素能夠促進(jìn)p53的磷酸化，而且成劑量依賴關(guān)系。與對照組未經(jīng)PFT-α預(yù)處理的RAFLSs相比，利用PFT-α預(yù)處理RAFLSs能夠顯著抑制槲皮素誘導(dǎo)的促進(jìn) p53蛋白磷酸化的作用，而且呈劑量依賴關(guān)系。DNA片段化法表明，PFT-α預(yù)處理還能夠顯著抑制槲皮素介導(dǎo)的促進(jìn)RAFLSs凋亡的作用。Western blot分析表明轉(zhuǎn)染p53特異siRNA導(dǎo)致RAFLSs中剩余的內(nèi)源性總p53

13、蛋白表達(dá)水平是對照組中內(nèi)源性總p53蛋白表達(dá)水平的13.2±2.5%（2?g siRNA）和3.1?0.4%（5?g siRNA）。在分子水平上，p53蛋白水平敲低顯著抑制槲皮素誘導(dǎo)的RAFLSs的凋亡。
　　結(jié)論：
　　槲皮素可促進(jìn)RAFLSs中p53蛋白的磷酸化；PFT-α預(yù)處理能夠抑制槲皮素誘導(dǎo)的對p53磷酸化和RAFLS凋亡的促進(jìn)作用；靶向抑制內(nèi)源性總p53蛋白表達(dá)可抑制槲皮素誘導(dǎo)的促RAFLS凋亡的作用。我們的結(jié)果