Furin和PCSK6對類風濕性關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞生物學功能的影響.pdf

1、論文分為四個部分:第一部分為綜述:類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞;第二部分為綜述:弗林蛋白酶furin——胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生;第三部分:抑制furin表達對類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響;第四部分:抑制PCSK6對類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響。
　　第一部分 類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞
　　RA是一種以關節(jié)滑膜炎癥和關節(jié)軟骨的破壞為特征的系統(tǒng)性自身

2、免疫性疾病，目前在臨床上雖然治療手段很多，但仍沒有特異性的治愈方法。RA的發(fā)病機制極其復雜，包含許多類型細胞的參與:T細胞、B細胞、巨噬細胞和FLS。分布于滑膜襯里層的FLS通過分泌多種介質，包括細胞因子、化學因子、生長因子和其他的一些促炎性分子如前列腺素和白介素等，在炎癥的發(fā)生、維持、關節(jié)軟骨破壞過程中到起關鍵作用。RA的FLS可以表現出一些腫瘤細胞的特性，可能與P53基因功能的失活有關，產生獨特的侵襲性表型，使其能夠侵襲細胞外基質，

3、進一步加劇關節(jié)損傷。FLS是RA發(fā)病過程中的關鍵因子之一。最近針對FLS的生物學研究進展包括它對固有免疫的調節(jié)、細胞內信號通路的調節(jié)等。對FLS的深入研究可以發(fā)現，FLS可以作為RA患者的一個新的治療靶點，從而完善目前RA的治療。
　　第二部分 弗林蛋白酶furin——胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生
　　弗林蛋白酶furin在體內介導了一個簡單的生化反應，催化前體蛋白水解為成熟蛋白。雖然這個反應看似簡單，furin生理作用卻極其重要。它

4、參與了人體內的多種生理過程，是維持人體穩(wěn)態(tài)平衡的重要分子。與furin相關的疾病相當廣泛，包括:阿爾茨海默病、腫瘤、炭疽和埃博拉出血熱等等。本篇綜述主要概括了furin的結構、活性、細胞內定位、細胞內轉運、作用底物、生物學特性以及與胚胎發(fā)生和多種疾病的關系。
　　第三部分 抑制furin表達對類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響
　　背景：
　　類風濕性關節(jié)炎RA是以滑膜慢性炎癥、關節(jié)軟骨和

5、骨的破壞為特點的一種系統(tǒng)性疾病。在RA中，正常滑膜從相對的靜止狀態(tài)轉變?yōu)榫哂性鲋承院颓忠u性的滑膜翳組織。RA的發(fā)病機制非常復雜，多種細胞類型參與其中，如淋巴細胞、巨噬細胞和滑膜細胞。其中，滑膜襯里層的FLS在RA的發(fā)病中起到了關鍵作用。FLS分泌一系列細胞因子、炎性介質以及多種蛋白水解酶，介導局部的炎癥反應，以及參與降解細胞外基質和軟骨蛋白。RA患者來源的FLS的生物學特性不同于健康個體或骨性關節(jié)炎患者。這些炎性滑膜來源的滑膜細胞表現出

6、一些轉化細胞的表型特征，如細胞的錨定不依賴性生長、過度增殖、細胞侵襲、以及對凋亡誘導的耐受等。在體外培養(yǎng)此類細胞時，這些滑膜細胞在沒有T細胞存在的情況下仍然可以長時間保持其侵襲力和破壞力。說明RA的關節(jié)破壞除了T細胞參與的自身免疫調節(jié)等機制，也有不依賴T細胞的以FLS為中心的機制。這類滑膜細胞是關節(jié)自分泌/旁分泌調控網絡中的關鍵因子，加重關節(jié)滑膜慢性炎性狀態(tài)和關節(jié)破壞。
　　RA的最近的一些治療進展主要集中于針對炎性細胞因子和淋巴

7、細胞免疫的生物治療，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)抑制劑，T細胞共刺激信號抑制劑，和B細胞清除劑等。在部分患者中這些生物治療是有效的。但仍有很大一部分患者對以上這些生物制劑沒有應答。因此，尋找新的治療靶點，尤其是針對RA的FLS的治療可能會完善現有治療方案。
　　Furin是PCs家族的重要成員之一，廣泛分布于機體各種細胞中。Furin主要位于細胞內高爾基體外側網絡(trans-Golgi n

8、etwork， TGN)，并在高爾基體外側網絡和細胞膜之間循環(huán)轉運。Furin能夠通過識別、剪切特定序列Arg-Xaa-(Lys/Arg)-Arg，水解多種前體蛋白，這一剪切過程是多種蛋白成熟活化的關鍵步驟，對蛋白質的功能起到重要的調節(jié)作用。最近的研究表明，furin參與了胚胎發(fā)育、機體穩(wěn)態(tài)和多種疾病發(fā)生發(fā)展等過程。然而在生殖細胞中敲除furin會使胚胎死亡，因此furin在各種細胞中的作用缺乏基因敲除動物這種有利的研究手段。既往有實驗

9、發(fā)現RA患者的關節(jié)滑膜翳中furin的表達明顯增加，但機制和作用尚不明了。Furin表達的上調可能會促進關節(jié)滑膜炎癥，也可能是滑膜對炎癥反應或自身免疫時的一種代償。因此，研究滑膜細胞上高表達的furin的作用是一個亟需解決的課題。
　　為了研究這個課題，我們設計了一系列實驗。將RA患者來源的FLS進行體外培養(yǎng)，將其高表達的furin使用RNA干擾技術進行基因抑制，研究抑制furin對滑膜細胞增殖、侵襲、遷移、細胞周期、細胞凋亡、分

10、泌炎癥因子的影響。從而證明furin在滑膜細胞生物學功能中的作用。
　　目的：
　　探索RA患者FLS細胞上高表達的furin對細胞的生物學功能的影響。
　　方法：
　　從RA患者行膝關節(jié)置換術后的滑膜組織中消化分離FLS進行體外培養(yǎng)，瞬時轉染小干擾RNA抑制細胞內furin表達，并設置對照組小干擾RNA，驗證siRNA-furin的干擾效率。進一步的研究使用兩組furin差異表達的FLS進行以下功能學實驗:(1

11、)MTT細胞增殖實驗;(2) Transwell細胞侵襲實驗;(3)單層細胞劃痕實驗;(4)細胞周期分析;(5)細胞凋亡分析;(6)酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)檢測FLS分泌白細胞介素(interleukin， IL) IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-17和TNF-α水平。研究兩組細胞在增殖、侵襲、遷移、凋亡、分泌等生物學功能中的差異。
　　結果：

12、r>　　利用siRNA-furin或siRNA-control干擾RA患者的FLS上furin的表達，研究其功能差別。得到以下結果:
　　(1)siRNA-furin在mRNA水平和蛋白水平均有效抑制FLS的furin表達。
　　(2)RA滑膜來源的FLS上furin表達的下調增強FLS細胞的增殖、侵襲和遷移能力;
　　(3)抑制furin表達加速FLS的細胞周期;
　　(4)抑制furin表達影響FLS的凋亡，

13、晚期凋亡和壞死細胞減少;
　　(5)抑制furin的表達使FLS分泌TNF-α和IL-1β增加;
　　結論：
　　(1)抑制RA滑膜FLS細胞上furin的表達增強了FLS細胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子等功能;
　　(2)RA滑膜細胞上furin的高表達可能是一種代償性反應，抑制滑膜細胞的增殖、侵襲、遷移等表型;
　　(3) Furin在循環(huán)和局部的作用不盡相同，具體機制有待進一步研究。
　　意

14、義：
　　RA是一種高度異質性疾病，炎癥、免疫、代謝等多個方面參與其發(fā)病機制。毫無疑問，關節(jié)滑膜襯里層的FLS是疾病的關鍵因子之一。我們發(fā)現，抑制RA滑膜細胞上高表達的furin基因會增強細胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子的能力。因此furin可能會作為RA的治療靶點之一從而完善現有治療。
　　第四部分 抑制PCSK6對類風濕性關節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響
　　類風濕性關節(jié)炎RA是以滑膜慢

15、性炎癥、關節(jié)軟骨和骨的破壞為特點的一種系統(tǒng)性疾病。RA來源的FLS表現出類似轉化細胞的侵襲特性，通過分泌一系列細胞因子、炎性介質以及多種蛋白水解酶，介導局部的炎癥反應，參與降解細胞外基質和軟骨蛋白，加重RA的關節(jié)損害。PCSK6是一種Ca2+依賴的絲氨酸蛋白水解酶，參與多種肽的活化過程。既往研究顯示PCSK6具有增強腫瘤細胞侵襲性和增值能力的作用。而且與骨性關節(jié)炎相比，PCSK6在RA滑膜上表達增高。因此我們設計一系列實驗研究PCSK6

16、對RA來源的FLS生物學功能的影響。
　　目的：
　　探索RA患者FLS細胞上PCSK6的表達對細胞的生物學功能的影響。
　　方法和結果：
　　從RA患者行膝關節(jié)置換術后的滑膜組織中消化分離FLS進行體外培養(yǎng)，應用siRNA轉染FLS細胞抑制PCSK6表達，并行qRT-PCR和Western blot檢測驗證PCSK6在mRNA和蛋白水平表達的降低。細胞轉染后進行的功能學實驗包括:(1)MTT細胞增殖實驗，證明抑

17、制RAFLS細胞PCSK6表達降低細胞的增殖能力;(2)Transwell細胞侵襲實驗，證明降低RA FLS細胞PCSK6表達抑制FLS細胞的侵襲能力;(3)單層細胞劃痕實驗，證明抑制PCSK6表達后RAFLS細胞遷移能力降低;(4) ELISA檢測FLS分泌功能，證明抑制PCSK6的表達使RAFLS分泌TNF-α水平降低。
　　結論：
　　(1)抑制PCSK6的表達降低了RA滑膜FLS細胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子等

18、功能;
　　(2)RA滑膜細胞上高表達的PCSK6可能通過促進FLS的增殖、侵襲、遷移等加速RA的關節(jié)損害;
　　(3)PCSK6和furin雖然同屬PCs家族，但對RA FLS細胞生物學功能的影響不同，具體機制有待進一步研究。
　　意義：
　　PCSK6和furin雖然同屬PCs家族，但在RA的關鍵致病因子之一FLS細胞的生物學功能中的影響卻不同。其中涉及的發(fā)病機制極其復雜。需要我們的進一步研究。因此PCs家族