神經(jīng)珠蛋白對心肌肥大、凋亡的影響及其機制的研究.pdf

1、背景:
　　神經(jīng)珠蛋白(neuroglobin，Ngb)又叫作腦紅蛋白，是一種主要表達(dá)于腦組織的攜氧球蛋白，能夠參與能量代謝、線粒體功能以及細(xì)胞生長和擴增的信號通路調(diào)節(jié)，并能維持神經(jīng)元細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)來應(yīng)對氧化應(yīng)激壓力。最近的研究表明Ngb在心肌細(xì)胞中也有較高的表達(dá)，然而其在心肌細(xì)胞中的具體作用機制仍然不是很清楚。本研究以大鼠H9c2成肌細(xì)胞為體外細(xì)胞模型和大鼠為動物模型，研究Ngb在心肌肥大及心肌細(xì)胞凋亡中的作用及其機制。
　　

2、目的:
　　1. 研究神經(jīng)珠蛋白對心肌肥大的影響;
　　2. 研究神經(jīng)珠蛋白對心肌細(xì)胞凋亡的影響;
　　3. 研究神經(jīng)珠蛋白調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的作用機制。
　　方法:
　　用含不同濃度的異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)(0 nM，10 nM，100 nM，500 nM，1μM)的培養(yǎng)基處理體外培養(yǎng)的大鼠H9c2成肌細(xì)胞12小時或者含有1μM異丙腎上腺素的培養(yǎng)基處理細(xì)胞0h，6h，12h，18

3、h，24 h，36h后，用倒置相差顯微鏡觀察H9c2成肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;用MTT方法檢測不同條件處理細(xì)胞后細(xì)胞的存活率;用Caspase-3還原酶試劑盒檢測細(xì)胞酶活力變化情況，同時使用Western雜交檢測Ngb及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量以及在細(xì)胞中的亞定位;并利用流式細(xì)胞術(shù)測定活性氧變化;流式細(xì)胞術(shù)PI單染法檢測細(xì)胞周期以及Annexin v-FITC PI雙染法檢測凋亡細(xì)胞所占比例。最后，在H9c2成肌細(xì)胞上轉(zhuǎn)染Ngb基因片段（過表達(dá)

4、Ngb）或NgbshRNA（敲除Ngb），并觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及對成肌細(xì)胞凋亡的影響并探討其作用機制。
　　結(jié)果
　　1. 心肌細(xì)胞的死亡率（壞死、凋亡）、肥大細(xì)胞比例，隨異丙腎上腺素藥物濃度以及作用時間的增加而增加，存活細(xì)胞的比例先減少后期則有所回升。在異丙腎上腺素藥物濃度為1μM和作用時間為12h時，心肌細(xì)胞的肥大比例和死亡率為最高。
　　2. HE染色和免疫組化技術(shù)檢測結(jié)果顯示，用異丙腎上腺素藥物處理后的大鼠心肌

5、細(xì)胞出現(xiàn)明顯的肥大，同時細(xì)胞中Ngb的表達(dá)顯著上升。
　　3. 流式細(xì)胞術(shù)Annexin v-FITC PI雙染法檢測細(xì)胞結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡在Ngb降低表達(dá)的（shRNA）心肌細(xì)胞中最為明顯，而在過表達(dá)Ngb的心肌細(xì)胞中最不明顯。
　　4. Western Blotting及實時熒光定量PCR(Quantitative RT-PCR，qPCR)
　　檢測p53、Bax、PUMA、NOXA、DR5、Scotin、Bcl-2

6、表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)這些基因在Ngb降低表達(dá)的心肌細(xì)胞中的表達(dá)在蛋白和mRNA水平上顯著升高，但在過表達(dá)Ngb的心肌細(xì)胞中表達(dá)在蛋白和mRNA水平上都顯著降低，Bcl-2則相反。
　　5. 流式細(xì)胞術(shù)檢測H9c2成肌細(xì)胞中活性氧的含量情況，結(jié)果顯示其活性氧的含量在Ngb降低表達(dá)的心肌細(xì)胞中含量最高，但在過表達(dá)Ngb的細(xì)胞中含量最低。
　　6. 將細(xì)胞活性氧抑制劑(N-acetyl-cysteine，ROS scavengere，N

7、AC)與異丙腎上腺素藥物共同作用H9c2成肌細(xì)胞后與單獨加入異丙腎上腺素相比，可見細(xì)胞內(nèi)活性氧含量顯著下降，所有組的H9c2細(xì)胞凋亡都明顯減少，其相對數(shù)量與以上凋亡檢測結(jié)果一致。說明ROS參與了凋亡的發(fā)生，且Ngb的作用與NAC相似，具有抗氧化作用。
　　結(jié)論:
　　1. 神經(jīng)珠蛋白在大鼠心肌細(xì)胞中都有表達(dá)并能夠顯著抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大。
　　2. 神經(jīng)珠蛋白能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量和p53途徑抑制異丙腎上