IRF-4結(jié)合蛋白（IBP）對T細(xì)胞凋亡的影響及其作用機制的初步研究.pdf

1、IRF-4結(jié)合蛋白IBP是新近發(fā)現(xiàn)與免疫突觸形成、T淋巴細(xì)胞激活及Th1/Th2極化關(guān)系密切的一個新分子。通過對IBP缺失小鼠的觀察，發(fā)現(xiàn)動物出現(xiàn)SLE樣自身免疫反應(yīng)，特征為血清IgG水平明顯升高、自身抗體產(chǎn)生、效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞積聚，但具體通過何種途徑引發(fā)疾病的機制未明。由于細(xì)胞凋亡在多細(xì)胞生物發(fā)育、自穩(wěn)態(tài)維持以及免疫保護(hù)和免疫調(diào)控中起著重要的作用，多種自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展均與免疫細(xì)胞凋亡紊亂及其引發(fā)的免疫自穩(wěn)失衡相關(guān)，本研究擬

2、應(yīng)用sinNA技術(shù)構(gòu)建IBP低表達(dá)T細(xì)胞株，通過研究激活狀態(tài)下凋亡的改變及引起改變的凋亡分子和通路，確定IBP低表達(dá)對T細(xì)胞凋亡的影響及其作用機制，為闡明IBP缺失引發(fā)自身免疫病的分子機制研究奠定基礎(chǔ)。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果 1．IBP siRNA穩(wěn)定表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)生物信息學(xué)分析，設(shè)計并合成IBP的三對siRNA靶位點序列和一對無關(guān)序列作為陰性對照，構(gòu)建GeneBuster siRNA重組載體。利用firef

3、ly luciferase和renilla luciferase雙熒光報告基因系統(tǒng)，將IBP cDNA全長克隆入pTRE-firefly luciferase基因5'端，檢測IBP抑制效率。通過檢測篩選出一條對IBP抑制效率為78％的有效序列(siRNA 178)。 2．建立IBP基因沉默細(xì)胞模型 (1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將IBP siRNA 178穩(wěn)定表達(dá)載體及陰性對照NC載體轉(zhuǎn)染高表達(dá)IBP的人白血病T細(xì)胞株Jurkat，利

4、用載體的neo抗性標(biāo)志，用G418的最小死亡劑量篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。 (2)mRNA水平定量方法：利用IBP和管家基因β-actin的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品繪制real timePCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立檢測IBP的real time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法。 (3)蛋白水平定量方法：構(gòu)建IBP原核表達(dá)載體PET-32a/IBP及PGEX-KG/IBP，表達(dá)純化后以6×his-IBP融合蛋白作為免疫原，GST-IBP重組蛋白作為鑒定抗原

5、，免疫兔制備IBP多克隆抗體，用Westernblotting從蛋白水平對IBP進(jìn)行定量。 經(jīng)熒光定量PCR和Western blotting檢測，篩選所得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的抑制效率為73％，陰性對照細(xì)胞無明顯抑制。 3．IBP在T細(xì)胞凋亡中的作用 (1)IBP低表達(dá)對TCR方式刺激下細(xì)胞增殖的影響：將IBP siRNA表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞命名為J.IBP<'->，陰性對照NC載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞命名

6、為J．NC。用終濃度5μg/ml的固相Anti-CD3、CD28mAb刺激的TCR信號方式作用于細(xì)胞使其激活，<'3>H-TdR摻入實驗檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示陰性對照細(xì)胞在此刺激下的增殖受到明顯抑制，J.IBP<'->則未受影響。 (2)IBP低表達(dá)對TCR方式刺激下細(xì)胞凋亡的影響：用相同的TCR信號方式激活細(xì)胞，Annexin-v/PI雙染色法對細(xì)胞進(jìn)行流式檢測。結(jié)果顯示J.NC在此刺激下發(fā)生明顯高于J.IBP<'->的凋亡，

7、分析原因可能是發(fā)生了激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(activation induced celldeath，AICD)，而IBP缺失后對此凋亡產(chǎn)生了抵抗，由此推斷IBP參與正常的細(xì)胞激活后凋亡。 (3)IBP所致凋亡途徑的研究：將IBP低表達(dá)細(xì)胞J.IBP<'->與高表達(dá)FasL的肝癌細(xì)胞SW480共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的凋亡變化。SW480通過混合培養(yǎng)能觸發(fā)淋巴細(xì)胞發(fā)生Fas途徑凋亡，J.IBP<'->與SW480細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，PI染色

8、經(jīng)流式檢測，發(fā)現(xiàn)IBP低表達(dá)后細(xì)胞凋亡率明顯降低。由此推測，IBP通過Fas凋亡途徑參與細(xì)胞的正常凋亡，進(jìn)而在免疫自穩(wěn)調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。此外，將包含IBP基因全長的pEGFP-C1/hIBP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T中，細(xì)胞激活后觀察到有部分細(xì)胞的IBP由胞漿轉(zhuǎn)運到核，提示IBP可能具有轉(zhuǎn)錄因子活性，參與Fas或Fas途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 綜上所述，本研究應(yīng)用siRNA技術(shù)構(gòu)建IBP低表達(dá)T細(xì)胞株，通過研究激活狀態(tài)下凋亡的改

9、變發(fā)現(xiàn)IBP低表達(dá)后能抵抗Fas途徑的凋亡，由此推出IBP通過Fas途徑參與T細(xì)胞激活后凋亡的調(diào)控。Fas介導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡在免疫自穩(wěn)、免疫調(diào)控等各種過程中均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它可使免疫細(xì)胞的活化增殖和機體的免疫應(yīng)答維持在一定的限度，避免發(fā)生過度免疫反應(yīng)損傷機體，使機體的免疫系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，進(jìn)而參與免疫自穩(wěn)的調(diào)節(jié)，故IBP在免疫自穩(wěn)中發(fā)揮重要作用。其作用機制可能是作為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入核內(nèi)參與調(diào)控Fas或相關(guān)基因的表達(dá)。本研究對于了解IB