NIRF蛋白對(duì)HBV核心蛋白的作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的
　　研究NIRF蛋白對(duì)HBV核心蛋白的作用及其機(jī)制。探索NIRF是否是HBc的一個(gè)E3 ligase。NIRF是否與HBc在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合，從而導(dǎo)致HBc的泛素化降解。探討NIRF對(duì)HBc表達(dá)和HBV復(fù)制、分泌的影響。
　　方法
　　1.以pIRES2-EGFP-NIRF為模板，PCR法擴(kuò)增NIRF基因編碼區(qū)序列，將其克隆至pCMV-Myc真核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Myc-NIRF。將其轉(zhuǎn)染H

2、EK293細(xì)胞，用Western blotting方法檢測(cè)NIRF的表達(dá)。以pCMV-Core為模板，PCR法擴(kuò)增HBc基因編碼區(qū)序列，將其克隆至pcDNA3真核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-HBc。將其轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，用Western blotting方法檢測(cè)HBc的表達(dá)。全基因合成泛素基因序列，構(gòu)建pcDNA3-UB質(zhì)粒。
　　2.在HEK293細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行NIRF與HBc的免疫熒

3、光共定位實(shí)驗(yàn)。
　　3.在HEK293和HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行NIRF與HBc免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。研究NIRF與HBc在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。
　　4.在HEK293細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行NIRF導(dǎo)致HBc降解的動(dòng)力學(xué)分析。在HEK293細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行泛素化研究，確定其降解是否是泛素化降解。
　　5.在HepG2.2.15細(xì)胞中，上調(diào)或者下調(diào)NIRF的表達(dá)。用Westernblotting的方法觀察HBc蛋白水平的變化。用實(shí)時(shí)熒光

4、PCR技術(shù)檢測(cè)HBV復(fù)制和分泌的情況。
　　結(jié)果
　　1.重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Myc-NIRF、pcDNA3-HBc和pcDNA3-UB構(gòu)建正確。
　　2.在HEK293細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)，NIRF與HBc均存在共定位現(xiàn)象。
　　3.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NIRF能與HBc在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互結(jié)合。且加入MG-132后，使得NIRF與HBc的含量升高。
　　4.NIRF在真核細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致HBc降

5、解，且該降解是泛素化降解。
　　5.NIRF上調(diào)后，HBc蛋白水平降低，HBV含量下降。NIRF下調(diào)后，HBc蛋白水平升高，HBV含量上升。
　　結(jié)論
　　成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Myc-MRF，pcDNA3-HBc和pcDNA3-UB。無論是外源性的NIRF與HBc，還是內(nèi)源性的NIRF與HBc，在細(xì)胞中均存在共定位現(xiàn)象。N1RF是HBc的一個(gè)E3 ligase。其在細(xì)胞內(nèi)與HBc相互結(jié)合，導(dǎo)致HBc的泛素化