NIRF蛋白在細(xì)胞外對(duì)HBV核心蛋白泛素化作用探討.pdf

1、目的:NIRF蛋白是泛素化E3連接酶,通過(guò)構(gòu)建各個(gè)表達(dá)質(zhì)粒,包括真核表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-NIRF,原核表達(dá)質(zhì)粒pGST-NIRF、pGST-HBc,并在HEK293細(xì)胞或E.coil BL21(DE3)中表達(dá),純化出GST-NIRF、GST-HBc蛋白;通過(guò)GST pull down證明NIRF與HBc在細(xì)胞外存在蛋白—蛋白相互作用;建立泛素化體系,探討HBc(HBVcore protein)能否被NIRF蛋白泛素化。
　　 方

2、法:
　　 (1)根據(jù)NIRF基因序列設(shè)計(jì)引物,NIRF基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后連接到pMD19T上,經(jīng)酶切連接后構(gòu)建pGST-NIRF原核表達(dá)質(zhì)粒;pGST-NIRF轉(zhuǎn)化E.coil BL21(DE3),優(yōu)化表達(dá)條件使GST-NIRF蛋白在上清中大量完整表達(dá),并探索一條高純度蛋白純化方法用以獲得GST-NIRF蛋白;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pCDNA3-HBc轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞,檢測(cè)其表達(dá);純化后的GST-NIRF蛋白與轉(zhuǎn)染pCDNA3

3、-HBc的細(xì)胞上清共同孵育,經(jīng)GST pull down證明2者之間是否存在相互結(jié)果。
　　 (2)根據(jù)HBc基因序列設(shè)計(jì)引物,HBc基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后連接到T載體pTArget上,經(jīng)酶切連接后構(gòu)建pGST-HBc原核表達(dá)質(zhì)粒;pGST-HBc轉(zhuǎn)化E.coil BL21(DE3)經(jīng)優(yōu)化表達(dá)條件后純化出GST-HBc蛋白;設(shè)計(jì)NIRF基因引物,基因經(jīng)擴(kuò)增后插入到p3*FLAG-CMV-10中構(gòu)建pFLAG-NIRF質(zhì)粒;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

4、法將pFLAG-NIRF轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞,檢測(cè)其表達(dá);純化后GST-HBc蛋白與轉(zhuǎn)染pFLAG-NIRF的細(xì)胞上清共同孵育,經(jīng)GST pull down證明2者之間是否存在相互結(jié)合。
　　 (3)純化后的GST-NIRF、GST-HBc蛋白用以構(gòu)建細(xì)胞外泛素化體系,分別作為泛素化E3連接酶及泛素化底物。泛素化反應(yīng)完成后,產(chǎn)物通過(guò)SDS-PAGE分離,蛋白免疫印跡檢測(cè)是否有泛素化條帶產(chǎn)生,從而確定NIRF是否能泛素化HBc。

5、
　　 結(jié)果:
　　 (1)成功構(gòu)建pGST-NIRF原核表達(dá)質(zhì)粒并在E.coil BL21(DE3)順利表達(dá),優(yōu)化表達(dá)條件得到GST-NIRF在細(xì)胞上清中的大量完整表達(dá),探索出一條GST-NIRF蛋白的純化方式獲得較高純度的GST-NIRF全長(zhǎng)蛋白,為蛋白相互作用鑒定及泛素化反應(yīng)奠定基礎(chǔ);通過(guò)GST pull down證明NIRF與HBc能夠在細(xì)胞外相互結(jié)合。
　　 (2)成功構(gòu)建pGST-HBc原核表達(dá)質(zhì)粒并

6、在E.coil BL21(DE3)順利表達(dá),優(yōu)化表達(dá)條件得到GST-HBc較高濃度表達(dá),純化出高濃度的GST-HBc蛋白;成功構(gòu)建pFLAG-NIRF真核表達(dá)質(zhì)粒,并在HED293細(xì)胞中順利表達(dá);通過(guò)GST pull down證明HBc與NIRF能夠在細(xì)胞外相互結(jié)合。
　　 (3)體外泛素化結(jié)果提示,HBc可能被NIRF泛素化。HBc抗體檢測(cè)效果不理想,無(wú)法準(zhǔn)確判定還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。
　　 結(jié)論:GST pull do