B、C型HBV核心蛋白細(xì)胞毒T細(xì)胞表位篩選以及功能意義研究.pdf

1、乙肝病毒(HBV)為一類(lèi)嗜肝性病毒，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，在中國(guó)HBV感染情況更為嚴(yán)重。HBV感染對(duì)人類(lèi)健康具有極大的威脅，也給人類(lèi)社會(huì)造成重大的損失。研究認(rèn)為特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)在清除HBV感染的過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。HBV感染后引起的CTL反應(yīng)是一把雙刃劍，既起著病毒清除的作用，但同時(shí)又造成了肝損傷。而病毒為了維護(hù)自身的生存會(huì)通過(guò)產(chǎn)生各種突變體來(lái)對(duì)抗機(jī)體的清除作用，且HBV突變被證明與乙肝疾病發(fā)展有著一定的關(guān)系。因

2、此，HBV感染中CTL反應(yīng)相關(guān)研究具有重要的理論及實(shí)際意義。
　　 目前已報(bào)道的CTL表位主要是由西方學(xué)者發(fā)現(xiàn)的，但西方國(guó)家與亞洲國(guó)家主要流行的HBV基因型并不相同?；谶@個(gè)情況，我們選取中國(guó)分布最多的B型和C型HBV作為研究對(duì)象，并選擇了HBV組成成分中保守性最好且免疫原性最強(qiáng)的核心蛋白(HBc)作為研究目標(biāo)。通過(guò)總結(jié)分析NCBI上171條B型HBc序列和159條C型HBc序列，利用overlapping方法合成涵蓋HBcl-

3、150全序列的九肽（每條多肽與相鄰多肽有8個(gè)氨基酸的重復(fù)），若某一氨基酸的突變率超過(guò)10％，覆蓋該突變氨基酸的一系列多肽也被包括在合成的范圍內(nèi)，合計(jì)共191條九肽。首先通過(guò)T2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)，篩選到四條HLA-A2高結(jié)合力的多肽(HBc60-68*，HBc123-131，HBc123-131*，HBc141-149)。隨后通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)學(xué)研究顯示這四條多肽具有典型的HLA-A*0201表位的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，但同時(shí)也具有一些新的特點(diǎn)，從而拓展了人們

4、對(duì)MHC-多肽復(fù)合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)上的認(rèn)識(shí)。其中HBc第60位突變(L60V)產(chǎn)生的新CTL表位（HBc60-68*，V60），引起我們極大的興趣，并對(duì)這一突變位點(diǎn)進(jìn)行了深入的研究。通過(guò)晶體學(xué)方法和功能學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的策略，證明V60具有典型的HLA-A*0201表位多肽的結(jié)構(gòu)特征，在小鼠體中可以產(chǎn)生很強(qiáng)的特異性CTL反應(yīng)，而其野生型多肽L60并不可以。通過(guò)分析HBV感染患者的臨床資料，觀察到HBc L60V突變與臨床更強(qiáng)的肝損傷，更高病毒水平

5、以及不良預(yù)后相關(guān)。隨后通過(guò)在HLA-A2.1/HBV雜交小鼠中進(jìn)行V60多肽免疫，我們證明V60刺激起的多肽特異性CTL反應(yīng)在雜交小鼠中造成了一定的肝損傷。另一方面，我們?cè)谝吧虷BV質(zhì)粒中引入HBc L60V突變，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，突變型質(zhì)粒的HBV復(fù)制水平明顯高于野生型質(zhì)粒，高壓尾靜脈注射野生型HBV質(zhì)粒與突變型質(zhì)粒進(jìn)入小鼠體內(nèi)也得到了同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞內(nèi)和原核表達(dá)野生型及突變型HBc蛋白，發(fā)現(xiàn)在同等

6、HBc蛋白表達(dá)量的情況下，突變型HBc蛋白包裝成核心顆粒的水平要明顯高于野生型蛋白，這就說(shuō)明了HBc L60V突變可能通過(guò)促進(jìn)HBc核衣殼的包裝來(lái)促進(jìn)HBV復(fù)制，而這個(gè)結(jié)果也解釋了含有HBcL60V突變的慢肝病人中HBV DNA水平更高的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中我們展示了一種新型HBV突變行為，該突變以產(chǎn)生一個(gè)新HLA-A2限制性CTL表位的代價(jià)而促進(jìn)了HBV復(fù)制。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HBc L60V突變影響了T細(xì)胞反應(yīng)，HBV復(fù)制以及乙肝疾病發(fā)展