附睪蛋白酶抑制蛋白的B細(xì)胞表位篩選及其抗生育效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、免疫性避孕一直是男性避孕節(jié)育研究的重要領(lǐng)域,具有巨大的臨床應(yīng)用前景和良好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而迄今為止沒有理想的避孕疫苗問世,究其原因最大的可能在于沒有理想的靶抗原。作為避孕疫苗應(yīng)用的的靶抗原應(yīng)當(dāng)至少滿足兩個(gè)條件,即抗原特異表達(dá)于生殖系統(tǒng)且參與生殖過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。
　　 近年來(lái),附睪蛋白酶抑制蛋白(Epidydimal protease inhibitor,Eppin)因在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出可靠的避孕效應(yīng)而備受關(guān)注。它特

2、異表達(dá)于睪丸和附睪,在精子成熟和生殖過(guò)程中具有重要作用。利用重組Eppin蛋白免疫雄猴獲得了78％抗生育效果,停止免疫后,71％的受試雄猴恢復(fù)了生育力。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)來(lái)自不育雄猴血清中的抗Eppin抗體可直接破壞人Eppin-精囊凝固蛋白(Semenogelin,Sg)復(fù)合體,干擾Eppin調(diào)控前列腺特異性抗原PSA對(duì)Sg的水解作用,影響人精子活動(dòng)力,進(jìn)而抑制生育力。因此,Eppin可能成為理想的避孕疫苗靶抗原。
　　 雖然對(duì)Ep

3、pin的研究有了一定的進(jìn)展,但仍存在如下問題:(1)蛋白抗原分子量較大,難以實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制;(2)未對(duì)抗原中可能導(dǎo)致遠(yuǎn)期毒副反應(yīng)的不良表位做剔除或加工。(3)抗體產(chǎn)生不穩(wěn)定;(4)隱匿的保護(hù)性表位功能未能表達(dá),所引發(fā)的保護(hù)性免疫不夠強(qiáng)大,免疫避孕效果不理想。因此,為了提高Eppin抗原的保護(hù)性,就不得不從天然抗原整個(gè)分子水平向表位水平過(guò)渡:摒除不良表位,保留、改善保護(hù)性表位以得到更理想的疫苗分子。表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ),正確而詳細(xì)地繪制

4、蛋白質(zhì)表位圖譜對(duì)設(shè)計(jì)疫苗分子結(jié)構(gòu)及免疫干預(yù)治療等具有重要意義。
　　 本研究首先通過(guò)RT-PCR法從人新鮮睪丸組織擴(kuò)增獲得Eppin cDNA,構(gòu)建入原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)純化獲得重組人Eppin蛋白(第一部分)。同時(shí),利用生物信息學(xué)方法分析Eppin蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原性、親水性、柔韌性、表面可及性等理化特性,預(yù)測(cè)Eppin蛋白的主要功能區(qū)域,根據(jù)該區(qū)域抗原趨勢(shì)指數(shù)分析結(jié)果,采用錯(cuò)位重疊套式方法設(shè)計(jì)該區(qū)域的肽段。利用人工合

5、成肽技術(shù)固相合成多肽,并與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián),用KLH偶聯(lián)肽與弗氏完全佐劑、不完全佐劑等體積混合,充分乳化后足摯皮下注射免疫小鼠,通過(guò)間接ELISA方法觀察各個(gè)表位肽刺激抗體的產(chǎn)生,通過(guò)體外、體內(nèi)抗生育實(shí)驗(yàn)觀察表位肽的抗生育效應(yīng),以此篩選出其優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位,并以rhEppin免疫為陽(yáng)性對(duì)照,分析其抗生育潛能及安全性(第二部分)。最后,設(shè)計(jì)并制備基于Eppin優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位的2分支MAP抗原肽,以

6、弗氏佐劑為佐劑,腹部皮下免疫雄性恒河猴,ELISA方法監(jiān)測(cè)免疫后被免疫雄猴血清抗體滴度,CBA方法檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞因子的改變,睪丸活檢術(shù)取睪丸標(biāo)本電鏡觀察免疫后睪丸超微結(jié)構(gòu)的變化,并與發(fā)情期雌猴合籠2個(gè)周期,觀察Eppin的MAP抗原肽對(duì)恒河猴的抗生育效果(第三部分)。
　　 結(jié)果顯示:①成功構(gòu)建了pET-32a-Eppin重組質(zhì)粒,并獲得了具有抗原特異性的可溶性Eppin蛋白。②通過(guò)分析Eppin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及表面特性,

7、初步預(yù)測(cè)出Eppin蛋白的89～133位氨基酸為主要功能區(qū)域,設(shè)計(jì)合成8條代表該氨基酸區(qū)域的肽段,并與載體蛋白KLH偶聯(lián),命名為F1-F8。③采用偶聯(lián)肽足墊皮下注射免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)8個(gè)候選表位肽都能激發(fā)高滴度的抗體,但僅F5肽所獲得的抗血清能與人精子天然Eppin蛋白結(jié)合,并能顯著抑制精卵結(jié)合,使雄鼠的生育力受到很大限制,從而獲得Eppin優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位為F5:FVYGGCQGNN(105～114區(qū)段)。④Eppin的MAP抗原肽免疫

8、的10只雄猴中有2只血清IgG抗體滴度始終無(wú)明顯提高,淘汰,剩余8只抗體滴度可達(dá)1:400～1600,但需2～3周加強(qiáng)免疫一次。合籠后發(fā)現(xiàn)對(duì)照組5只有4只受孕,實(shí)驗(yàn)組8只僅3只受孕,顯示了較肯定的避孕效果。電鏡結(jié)果未發(fā)現(xiàn)免疫后睪丸組織超微結(jié)構(gòu)的損害,CBA細(xì)胞因子檢測(cè)未見Th1/Th2極化改變,各細(xì)胞因子免疫前后無(wú)明顯差異。提示合成肽對(duì)T細(xì)胞功能的影響甚微,今后的劑型改造可以考慮增強(qiáng)T細(xì)胞功能,在佐劑、遞呈方式上做優(yōu)化。