附睪蛋白酶抑制蛋白的B細胞表位篩選及其抗生育效應的實驗研究.pdf

1、免疫性避孕一直是男性避孕節(jié)育研究的重要領域,具有巨大的臨床應用前景和良好的社會經濟價值。然而迄今為止沒有理想的避孕疫苗問世,究其原因最大的可能在于沒有理想的靶抗原。作為避孕疫苗應用的的靶抗原應當至少滿足兩個條件,即抗原特異表達于生殖系統(tǒng)且參與生殖過程中的重要環(huán)節(jié)。
　　 近年來,附睪蛋白酶抑制蛋白(Epidydimal protease inhibitor,Eppin)因在非人靈長類動物實驗中顯示出可靠的避孕效應而備受關注。它特

2、異表達于睪丸和附睪,在精子成熟和生殖過程中具有重要作用。利用重組Eppin蛋白免疫雄猴獲得了78％抗生育效果,停止免疫后,71％的受試雄猴恢復了生育力。體外實驗發(fā)現(xiàn)來自不育雄猴血清中的抗Eppin抗體可直接破壞人Eppin-精囊凝固蛋白(Semenogelin,Sg)復合體,干擾Eppin調控前列腺特異性抗原PSA對Sg的水解作用,影響人精子活動力,進而抑制生育力。因此,Eppin可能成為理想的避孕疫苗靶抗原。
　　 雖然對Ep

3、pin的研究有了一定的進展,但仍存在如下問題:(1)蛋白抗原分子量較大,難以實現(xiàn)質量控制;(2)未對抗原中可能導致遠期毒副反應的不良表位做剔除或加工。(3)抗體產生不穩(wěn)定;(4)隱匿的保護性表位功能未能表達,所引發(fā)的保護性免疫不夠強大,免疫避孕效果不理想。因此,為了提高Eppin抗原的保護性,就不得不從天然抗原整個分子水平向表位水平過渡:摒除不良表位,保留、改善保護性表位以得到更理想的疫苗分子。表位是蛋白質抗原性的基礎,正確而詳細地繪制

4、蛋白質表位圖譜對設計疫苗分子結構及免疫干預治療等具有重要意義。
　　 本研究首先通過RT-PCR法從人新鮮睪丸組織擴增獲得Eppin cDNA,構建入原核表達載體,誘導表達并經純化獲得重組人Eppin蛋白(第一部分)。同時,利用生物信息學方法分析Eppin蛋白的二級結構及抗原性、親水性、柔韌性、表面可及性等理化特性,預測Eppin蛋白的主要功能區(qū)域,根據(jù)該區(qū)域抗原趨勢指數(shù)分析結果,采用錯位重疊套式方法設計該區(qū)域的肽段。利用人工合

5、成肽技術固相合成多肽,并與載體蛋白鑰孔血藍蛋白(KLH)、牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián),用KLH偶聯(lián)肽與弗氏完全佐劑、不完全佐劑等體積混合,充分乳化后足摯皮下注射免疫小鼠,通過間接ELISA方法觀察各個表位肽刺激抗體的產生,通過體外、體內抗生育實驗觀察表位肽的抗生育效應,以此篩選出其優(yōu)勢中和B細胞表位,并以rhEppin免疫為陽性對照,分析其抗生育潛能及安全性(第二部分)。最后,設計并制備基于Eppin優(yōu)勢B細胞表位的2分支MAP抗原肽,以

6、弗氏佐劑為佐劑,腹部皮下免疫雄性恒河猴,ELISA方法監(jiān)測免疫后被免疫雄猴血清抗體滴度,CBA方法檢測Th1/Th2細胞因子的改變,睪丸活檢術取睪丸標本電鏡觀察免疫后睪丸超微結構的變化,并與發(fā)情期雌猴合籠2個周期,觀察Eppin的MAP抗原肽對恒河猴的抗生育效果(第三部分)。
　　 結果顯示:①成功構建了pET-32a-Eppin重組質粒,并獲得了具有抗原特異性的可溶性Eppin蛋白。②通過分析Eppin蛋白二級結構及表面特性,

7、初步預測出Eppin蛋白的89～133位氨基酸為主要功能區(qū)域,設計合成8條代表該氨基酸區(qū)域的肽段,并與載體蛋白KLH偶聯(lián),命名為F1-F8。③采用偶聯(lián)肽足墊皮下注射免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)8個候選表位肽都能激發(fā)高滴度的抗體,但僅F5肽所獲得的抗血清能與人精子天然Eppin蛋白結合,并能顯著抑制精卵結合,使雄鼠的生育力受到很大限制,從而獲得Eppin優(yōu)勢中和B細胞表位為F5:FVYGGCQGNN(105～114區(qū)段)。④Eppin的MAP抗原肽免疫

8、的10只雄猴中有2只血清IgG抗體滴度始終無明顯提高,淘汰,剩余8只抗體滴度可達1:400～1600,但需2～3周加強免疫一次。合籠后發(fā)現(xiàn)對照組5只有4只受孕,實驗組8只僅3只受孕,顯示了較肯定的避孕效果。電鏡結果未發(fā)現(xiàn)免疫后睪丸組織超微結構的損害,CBA細胞因子檢測未見Th1/Th2極化改變,各細胞因子免疫前后無明顯差異。提示合成肽對T細胞功能的影響甚微,今后的劑型改造可以考慮增強T細胞功能,在佐劑、遞呈方式上做優(yōu)化。