番鴨細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白B細(xì)胞抗原表位的篩選及應(yīng)用.pdf

1、番鴨（Cairna moschata），又稱疣鼻棲鴨，屬于棲鴨類。華盛頓公約(CITES)將其野生種群列入附錄三物種。野生番鴨棲息于熱帶地區(qū)，目前，在墨西哥、巴西和巴拉圭等國有其野生種群。因?yàn)榉喚哂休^大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其人工飼養(yǎng)數(shù)量逐年不斷增加。番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)引起，以1-3周齡雛番鴨為易感的一種急性傳染性、高死亡率的病毒病。耐過鴨往往生長發(fā)育遲緩，成為僵鴨，失去其

2、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。該病呈世界范圍分布，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。MDPV只有一個(gè)血清型，從世界各地分離的病毒僅有微小差異。番鴨感染MDPV后，主要以體液免疫反應(yīng)為主。B細(xì)胞抗原表位決定著機(jī)體產(chǎn)生抗體的特異性，是誘導(dǎo)體液免疫的基本單位。但至今國內(nèi)外對MDPV蛋白的B細(xì)胞抗原表位知之甚少。病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白是在病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的，感染動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生抗非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體，而滅活疫苗或亞單位疫苗免疫的動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生針對病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。因此可以利用非

3、結(jié)構(gòu)蛋白抗體的存在與否來區(qū)分滅活疫苗免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物。
　　為了對MDPV YL08株NS1蛋白（氨基酸序列全長627aa）進(jìn)行抗原表位作圖，本研究設(shè)計(jì)了一套覆蓋整個(gè)NS1蛋白的短肽，這些短肽長為30個(gè)氨基酸左右，有10個(gè)氨基酸重疊。為了表達(dá)這些短肽，共設(shè)計(jì)合成了31對互補(bǔ)的寡核苷酸片段。每對寡核苷酸片段5'端磷酸化。上述寡核苷酸片段退火后，插入至原核表達(dá)載體pET-32a中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了相應(yīng)重組蛋白的表達(dá)。利用切膠

4、純化的方法對表達(dá)蛋白進(jìn)行了純化。純化蛋白經(jīng)抗His單克隆抗體鑒定。應(yīng)用MDPV YL08株人工感染番鴨血清對表達(dá)的31個(gè)重組蛋白的抗原性進(jìn)行了檢測，Western blot結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白NS(481-510)、NS(501-530)、NS(521-550)、NS(541-570)、NS(561-590)、NS(581-610)和NS(601-627)能被MDPV感染血清所識別，而其他融合蛋白不能被MDPV感染血清所識別。綜合上

5、述試驗(yàn)結(jié)果，MDPV YL08株NS1蛋白的B細(xì)胞線性抗原表位區(qū)位于NS1蛋白的羧基末端481～627 aa。Dot-ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明融合蛋白NS(501-530)的抗原性最強(qiáng)。
　　以純化的融合蛋白NS(501-530)為包被抗原建立了間接ELISA檢測方法。確定了滅活疫苗免疫番鴨和自然感染番鴨的臨界值為0.300。對240份陽性血清進(jìn)行檢測，陽性符合率為100％。對100份陰性血清進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果為:30份健康番鴨血清

6、中有1份的檢測值略高于臨界值;70份滅活疫苗免疫血清中有1份的檢測值略高于臨界值，檢測準(zhǔn)確率為98.0％。本研究建立的ELISA檢測方法與鴨瘟病毒(Duck plaguevirus，DPV)，鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）和鴨呼腸孤病毒(duckreovirus，DRV)等陽性血清無交叉反應(yīng)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該ELISA檢測方法的敏感性優(yōu)于中和實(shí)驗(yàn)。ELISA的板內(nèi)及板間變異系數(shù)均小于10％，重復(fù)性較

7、好。對含有抗原表位NS(501-530)的重組蛋白抗體消長規(guī)律分析表明，重組蛋白抗體在番鴨感染MDPV后第1周即可檢測到，第3周達(dá)到最高峰，以后效價(jià)開始略有下降，一直可持續(xù)到第12周。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證明該ELISA檢測方法可應(yīng)用于MDPV滅活疫苗免疫番鴨和MDPV自然感染番鴨的鑒別診斷。
　　本研究建立的基于NS蛋白抗原表位的ELISA檢測方法，為MDPV的快速診斷、疫情監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查和免疫抗體效價(jià)測定提供了一定的技術(shù)支持。特