細小病毒H-1-重組細小病毒對胃癌細胞的作用研究.pdf

1、目的：觀察細小病毒H-1感染后對胃癌細胞凋亡及核修復相關(guān)基因表達的影響，試從分子水平探討其對胃癌細胞毒作用的相關(guān)機制。構(gòu)建和鑒定表達人IL-2／P27／P21蛋白的重組細小病毒H-1，了解該表達載體對胃癌細胞株HGC27的作用，為進一步研究IL-2／p27／p21的生物學作用以及利用細小病毒載體進行腫瘤基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法：選取人胃癌細胞株HGC27和BGC823，運用基因芯片技術(shù)分析HGC27細胞基因表達譜的改變，用RT-

2、PCR和實時定量PCR分別對部分凋亡和核修復相關(guān)基因的表達作進一步驗證，并比較BGC823細胞中相應(yīng)基因的表達差異。采用RT-PCR技術(shù)克隆p27／p21cDNA片斷并插入質(zhì)粒PHl-△800中構(gòu)成重組載體質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切篩選鑒定陽性克隆，通過重組載體質(zhì)粒(PHl-△800／IL-2，PHl-△800／p27和NPHl-△800／p21)與輔助質(zhì)粒pBK38VP共轉(zhuǎn)染T293細胞，獲得含有外源性治療基因的重組細小病毒(rhHlA／IL-2

3、，rhHiA／p27，rhHl△／p21)，并進一步轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株HGC27，觀察細胞形態(tài)學改變，Westem Blot鑒定其轉(zhuǎn)移基因的蛋白質(zhì)表達，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)移基因表達，MTT法檢測其對HGC27細胞生長的抑制作用，流式細胞分析其對細胞增殖周期的影響。 結(jié)果：基因芯片結(jié)果顯示15對凋亡相關(guān)基因表達下調(diào)，僅l對上調(diào)；12對核修復相關(guān)基因表達下調(diào)，6對上調(diào)。RT-PCR結(jié)果示HGC27細胞的SARPl、BCL-10、CL

4、-20和NCDRP表達下調(diào)，RAIDD無改變；BGC823細胞的BCL-10和NCDRP表達上調(diào)，CL-20和RAIDD無改變，SARPl不表達。定量PCR結(jié)果示HGC27細胞中BTG2表達下調(diào)，MBD2上調(diào)，XRCC4和H2AZ無改變；BGC823細胞中BTG2表達下調(diào)，XRCC4，H2AZ和MBD2無改變。重組載體質(zhì)粒PHl-△800／p27和PHI-△800／p21酶切后篩選得到陽性克隆片段，基因序列經(jīng)測序無突變。將重組細小病毒轉(zhuǎn)

5、染人胃癌細胞株HGC27后，經(jīng)Western Blot及RT-PCR檢測鑒定均表明已成功轉(zhuǎn)入胃癌HGC27細胞內(nèi)，并過表達外源性治療基因蛋白IL-2／P27／P21，并使細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞周期比例改變，細胞周期停滯，從而抑制胃癌細胞增殖。 結(jié)論：細小病毒H-1可能通過改變一些凋亡或核修復相關(guān)基因的表達，進而調(diào)節(jié)細胞基因轉(zhuǎn)錄或周期進展來誘導胃癌細胞死亡。本研究成功構(gòu)建了感染性重組細小病毒H-1，可在胃癌細胞內(nèi)過表達所攜帶