FXR對(duì)肝型脂肪酸結(jié)合蛋白表達(dá)的影響及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究背景:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver,NAFL)是一種非過量飲酒所致的,以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征,其中肝脂肪酸代謝異常與NAFL發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),L-FABP是脂肪結(jié)合蛋白超家族的一員,在肝臟和小腸中高表達(dá),調(diào)節(jié)著脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化以及酯化,近年來研究發(fā)現(xiàn),L-FABP缺陷型小鼠能有效抵抗高脂飲食所誘導(dǎo)的脂肪肝,因而研究L-FABP對(duì)防治脂肪肝有重要意義。法尼酯X受體

2、(farnesoid X receptor,FXR)是核受體超家族成員,通過調(diào)節(jié)諸多靶基因而在調(diào)控膽汁酸、脂類和葡萄糖的代謝過程中發(fā)揮著極其重要的作用,FXR的功能喪失與非酒精性脂肪肝密切相關(guān)。FXR和L-FABP主要在肝臟中表達(dá),兩者均與NAFL中有密切關(guān)系,那么研究FXR是否調(diào)控L-FABP的表達(dá),將為進(jìn)一步闡明二者在NAFL發(fā)生發(fā)展中的作用及為尋找防治NAFL的新靶點(diǎn)提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　 研究目的:探討FXR對(duì)L-FA

3、BP表達(dá)的影響及其調(diào)節(jié)的可能機(jī)制。
　　 研究方法:1.選取人胎肝細(xì)胞株L02和人肝癌細(xì)胞株HepG2為細(xì)胞模型,經(jīng)FXR特異性激動(dòng)劑CDCA或GW4064處理后,用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法和Western blotting免疫印跡法分別檢測(cè)L-FABP在mRNA和蛋白水平的差異變化。2.用不同濃度的FXR激動(dòng)劑CDCA(0mg/kg、10mg/kg、50mg/kg)灌胃C57BL/6小鼠7天后,取小鼠肝組織,采用

4、半定量RT-PCR檢測(cè)L-FABPmRNA表達(dá)水平,免疫組化和Western blotting免疫印跡法檢測(cè)L-FABP蛋白表達(dá)變化。3.在線預(yù)測(cè)人L-FABP基因5'側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)域存在FXR可能結(jié)合位點(diǎn),DR9分值最高,為FXR的結(jié)合位點(diǎn)的可能性最大;提取HepG2細(xì)胞基因組DNA,PCR擴(kuò)增包含DR-9的L-FABP基因啟動(dòng)子區(qū),構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒pGL-2984/+128,以及構(gòu)建不含DR9位點(diǎn)的pGL-2172/+11

5、,利用脂質(zhì)體,將其與FXR的表達(dá)質(zhì)粒Vp-FXR共轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中,24小時(shí)后檢測(cè)各組報(bào)告基因表達(dá)活性。
　　 研究結(jié)果:1.經(jīng)FXR特異性激動(dòng)劑GW4064或CDCA處理后,L02和HepG2細(xì)胞內(nèi)的L-FABPmRNA和蛋白水平顯著下降(p＜0.05)。2.動(dòng)物在喂食含CDCA食物7天后,經(jīng)RT-PCR測(cè)得L-FABPmRNA水平有明顯下調(diào);免疫組化結(jié)果顯示:隨著CDCA濃度的增加;L-FABP在肝臟組織的表達(dá)呈下降水

6、平;Western blotting免疫印跡法結(jié)果表明:L-FABP蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比也顯著降低。3.在HepG2細(xì)胞中,共轉(zhuǎn)染Vp-FXR可降低含DR9位點(diǎn)的pGL-2984/+128活性,但對(duì)不含DR9位點(diǎn)的pGL-2172/+11的活性無影響。
　　 研究結(jié)論:實(shí)驗(yàn)證實(shí)FXR激活后在體內(nèi)外均可下調(diào)L-FABP的表達(dá)。因此,我們可以推測(cè)L-FABP是FXR作用于肝臟的新的靶基因。通過報(bào)告基因分析,FXR調(diào)控L-FABP的表