FXR對(duì)apoM表達(dá)的影響及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、研究背景:
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的心腦血管疾病。體內(nèi)脂代謝紊亂與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成密切相關(guān)。類(lèi)法尼醇X受體(famesoid X receptor,FXR)是孤兒核受體(orphan nuclear receptor)家族成員,是內(nèi)源性膽汁酸(bile acids)的感應(yīng)器(sensor),鵝脫氧膽汁酸(chenodexycholic acid,CDCA)為其最適天然配

2、體。FXR通過(guò)調(diào)節(jié)諸多靶基因而調(diào)控脂類(lèi)、膽固醇和葡萄糖的代謝,其在維持脂代謝平衡、膽汁酸代謝過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。FXR與AS的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 載脂蛋白(apolipoproteinM,apoM)是一種新近發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白,它含有一個(gè)特征性的疏水結(jié)合盒。成熟的apoM保留了具有“疏水錨”作用的信號(hào)肽。研究發(fā)現(xiàn)apoM可能通過(guò)此信號(hào)肽錨著在高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)磷脂單層中,

3、并且在HDL中含量極為豐富。研究結(jié)果表明apoM可通過(guò)影響膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程參與HDL的代謝過(guò)程,進(jìn)而發(fā)揮重要的抗AS的功能。
　　 由于FXR和apoM均高表達(dá)于肝臟,且二者均與AS密切相關(guān)。那么apoM是否受FXR的調(diào)節(jié)?弄清該問(wèn)題,對(duì)進(jìn)一步闡明二者在AS發(fā)生發(fā)展中的作用,為防治AS的新靶點(diǎn)提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　 研究目的:探討FXR對(duì)apoM表達(dá)的影響及其調(diào)控的可能機(jī)制。
　　 研究方法:
　　

4、 (1)選取肝癌細(xì)胞株HepG2和胎肝細(xì)胞株L02為細(xì)胞模型,經(jīng)FXR激動(dòng)劑(CDCA)處理細(xì)胞24h后,用RT-PCR法檢測(cè)apoM表達(dá)的變化;經(jīng)FXR激動(dòng)劑(CDCA)處理細(xì)胞12h后,再用FXR的抑制劑(Guggulsterones)處理細(xì)胞24h,RT-PCR法檢測(cè)apoM表達(dá)的變化。
　　 (2)選取肝癌細(xì)胞株HepG2為細(xì)胞模型,Western blotting免疫印跡法檢測(cè)apoM蛋白表達(dá)的差異。
　　 (

5、3)選取C57BL/6小鼠為動(dòng)物模型,喂食CDCA后,RT-PCR法檢測(cè)小鼠肝臟組織apoM mRNA表達(dá)的變化,Western blotting免疫印跡法檢測(cè)小鼠肝臟組織apoM蛋白表達(dá)的差異。同時(shí)用免疫組化法檢測(cè)小鼠肝、腎組織的表達(dá)。用勻相測(cè)定法檢測(cè)小鼠血脂的變化。
　　 (4)通過(guò)生物信息學(xué)分析,在線預(yù)測(cè)人apoM基因5'側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)域AGGTCAggAGTTCA存在FXR可能結(jié)合位點(diǎn)(DR2):提取HepG2細(xì)胞基因組D

6、NA,PCR法擴(kuò)增人apoM報(bào)告基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒PGL3-basic/apoM(-1900～+165含DR2序列)和PGL3-basic/apoM(-1800～+165不含DR2序列)。脂質(zhì)體法將vpFXR真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)FXR對(duì)apoM啟動(dòng)子活性影響。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)在FXR激動(dòng)劑(CDCA)處理的人肝癌細(xì)胞HepG2和胎肝細(xì)胞L02中,發(fā)現(xiàn)FXR顯著下調(diào)

7、apoM的表達(dá)(p＜0.05)。
　　 (2)在FXR活化后再用抑制劑(Guggulsterones)處理的人肝癌細(xì)胞HepG2和胎肝細(xì)胞L02中,發(fā)現(xiàn)FXR顯著上調(diào)apoM的表達(dá)(p＜0.05)。
　　 (3)C57BL/6小鼠喂食含CDCA的食物,FXR活化后在體內(nèi)可下調(diào)小鼠肝臟apoM的表達(dá)。
　　 (4)小鼠免疫組化結(jié)果顯示:隨著CDCA濃度的增加,小鼠肝臟和腎臟apoM的表達(dá)下降。
　　 (5)

8、小鼠血脂測(cè)定結(jié)果顯示:HDL和TC隨CDCA濃度的升高而下降,LDL隨CDCA濃度升高而升高,TG隨著CDCA濃度的升高先升高再下降。
　　 (6)根據(jù)生物信息學(xué)分析人apoM基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3000bp區(qū)域,得出在-1863bp處存在可能FXR結(jié)合位點(diǎn)(DR2)。通過(guò)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:FXR可降低人apoM(-1900～+165)含有DR2序列啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄活性,且下調(diào)幅度為對(duì)照的40％。而FXR對(duì)不含有DR2序列的人

9、apoM(-1800～+165)啟動(dòng)子片段活性無(wú)影響。
　　 結(jié)論:
　　 (1)用FXR激動(dòng)劑(CDCA)處理細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)FXR顯著下調(diào)apoM的表達(dá)(p＜0.05)。
　　 (2)用FXR抑制劑(Guggulsterones)處理細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)FXR顯著上調(diào)apoM的表達(dá)(p＜0.05)。
　　 (3)FXR活化后可下調(diào)小鼠體內(nèi)apoM的表達(dá)。
　　 (4)通過(guò)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出:FXR可能通過(guò)