Geminin基因過表達(dá)對VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響及其分子機(jī)制探討.pdf

1、一、研究背景
　　 在動脈粥樣硬化、高血壓以及血管成形術(shù)后再狹窄等增生性血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)的表型轉(zhuǎn)化在這些疾病中發(fā)揮著非常重要的作用。VSMCs由分化表型向去分化表型的轉(zhuǎn)化引起VSMCs的增殖和遷移，使處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞，重新獲得增殖能力，引發(fā)一系列的血管病變。VSMCs通常有兩種不同的表型狀態(tài)：分化表型和去分化表型，兩者在一定條件下可

2、以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。不同表型狀態(tài)的VSMCs有其標(biāo)志性的表型標(biāo)志物，分化表型的主要表型標(biāo)志物為α-actin，去分化表型的主要表型標(biāo)志物為OPN。Geminin是細(xì)胞周期起始特許阻遏子，它通過整合細(xì)胞周期和細(xì)胞分化，在細(xì)胞的增殖-分化過程中起到了“開關(guān)”作用。它既可以使細(xì)胞穩(wěn)定在分化表型、又可以阻抑去分化表型細(xì)胞的DNA再次復(fù)制，以確保細(xì)胞基因信息遺傳的穩(wěn)定性。我們的前期研究顯示，Geminin參與了VSMCs的表型轉(zhuǎn)化，在不同表型狀態(tài)的V

3、SMCs中均有表達(dá)，但在分化表型中的表達(dá)較去分化表型中多。有研究顯示，Geminin基因經(jīng)siRNA干擾處理后，可以使細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，甚至過度增殖。Geminin是如何引起表型轉(zhuǎn)化的，其具體機(jī)制如何，目前還不甚清楚。在VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的過程中，肌動蛋白發(fā)生相應(yīng)的聚合和解離，這些是影響VSMCs處于不同表型的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，肌動蛋白相關(guān)蛋白(actin relatedprotein1，ARP1)在影響肌動蛋白聚合和解離的過程中也發(fā)揮著十

4、分重要的作用。
　　 在VSMCs由分化表型向去分化表型轉(zhuǎn)化的過程中，VSMCs獲得增殖能力是前提；同時Geminin參與了VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。結(jié)合前期實驗及目前的研究進(jìn)展，我們推測：Geminin基因過表達(dá)可以促進(jìn)VSMCs由去分化表型向分化表型轉(zhuǎn)化，ARP1可能參與了上述Genunin影響VSMCs的表型轉(zhuǎn)化過程。
　　 二、研究目的
　　 通過對不同表型VSMCs進(jìn)行Geminin基因過表達(dá)處理，了解Ge

5、minin如何影響VSMCs的表型轉(zhuǎn)化，為探索增生性血管疾病的防治提供新思路。
　　 三、研究方法
　　 1、不同表型VSMCs的培養(yǎng)
　　 VSMCs株(A10)被培養(yǎng)。采用10%FBS DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h獲得去分化表型VSMCs，無血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h獲得分化表型VSMCs。實驗設(shè)置陽性組、陰性對照組和空白對照組(n=3)。
　　 2、pEGFP-N1-Geminin真核表達(dá)載體

6、的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
　　 從VSMCs中提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增Geminin基因。pEGFP-N1質(zhì)粒、Geminin片段均選用HindⅢ、sacⅡ雙酶切后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后利用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，采用雙酶切和基因測序進(jìn)行鑒定。構(gòu)建的載體利用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染不同表型的VSMCs，通過熒光顯微鏡和Westernblotting半定量的方法檢測轉(zhuǎn)染效果。
　　 3、檢測VSMC

7、s中主要表型標(biāo)志物的變化
　　 采用Western blotting半定量的方法，選擇GAPDH和β-actin作為內(nèi)參，檢測不同表型VSMCs經(jīng)pEGFP-N1-Geminin過表達(dá)處理后，主要表型標(biāo)志物(α-actin、OPN)的表達(dá)變化情況。
　　 4、檢測ARP1的表達(dá)變化及Geminin和ARP1之間的相互作用
　　 采用Western blotting半定量的方法，選擇GAPDH作為內(nèi)參，檢測VSMC

8、s經(jīng)pEGFP-N1-Geminin過表達(dá)處理后，ARP1的表達(dá)變化情況。并通過免疫共沉淀技術(shù)檢測Geminin和ARP1兩者間是否存在相互作用。
　　 四、研究結(jié)果
　　 1、成功獲取具有代表性的不同表型的VSMCs。
　　 2、通過酶切反應(yīng)和基因測序鑒定，證實目的基因Geminin成功插入真核表達(dá)載體pEGFP-N1。利用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到60%，Western blotting半定量

9、分析進(jìn)一步證實Geminin在陽性組中的表達(dá)明顯高于陰性對照組和空白對照組，說明Geminin被成功過表達(dá)，滿足后續(xù)實驗的開展。
　　 3、分化表型A10細(xì)胞株中，陽性組、陰性對照組和空白對照組中α-actin比GAPDH的相對光密度平均值分別是(1.14±0.03)、(1.14±0.02)、(1.12±0.02)；去分化表型A10細(xì)胞株中分別是(1.14±0.03)、(0.84±0.03)、(0.82±0.02)，分化表型VS

10、MCs中各組無明顯差異，去分化表型VSMCs陽性組中α-actin表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。分化表型A10細(xì)胞株中陽性組、陰性對照組和空白對照組OPN比β-actin的相對光密度平均值分別是(0.31±0.02)、(0.34±0.03)、(0.30±0.02)。去分化表型A10細(xì)胞株中分別是(0.33±0.03)、(0.65±0.03)、(0.62±0.03)，分化表型VSMCs中OPN的表達(dá)無明顯差異，去分化表型VS

11、MCs陽性組中OPN表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 4、分化表型A10細(xì)胞株中陽性組、陰性對照組和空白對照組ARP1比GAPDH的相對光密度平均值分別是(1.31±0.03)、(1.31±0.03)、(1.32±0.03)；去分化表型A10細(xì)胞株中分別是(1.27±0.03)、(0.98±0.03)、(0.96±0.03)，分化表型VSMCs中ARP1蛋白表達(dá)無顯著差異，去分化表型陽性組中ARP1表達(dá)上調(diào)，