過表達(dá)TLP對(duì)瘢痕形成的影響及基因干預(yù)評(píng)價(jià).pdf

1、目的：TGF-β1在細(xì)胞內(nèi)通過下游Smad發(fā)揮介導(dǎo)作用，在創(chuàng)傷愈合、瘢痕形成和攣縮過程中的主要因子是Smad3，已證實(shí)抑制Smad3基因的表達(dá)能有效減少病理性瘢痕的形成。新近發(fā)現(xiàn)一種胞內(nèi)蛋白TLP，能夠阻斷Smad3而不影響其他信號(hào)通路。本課題選用復(fù)制缺陷型腺病毒作為基因治療的載體，將TLP基因轉(zhuǎn)入體外瘢痕成纖維細(xì)胞，探討對(duì)細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)的影響；并利用瘢痕動(dòng)物模型，研究體內(nèi)改善創(chuàng)傷愈合和治療瘢痕增生的效果。 方法：①正常皮膚、增

2、生性瘢痕、瘢痕疙瘩組織進(jìn)行HE、Masson染色，實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較三種組織中TGF-β1、Smad3、TLP mRNA表達(dá)；②用AdMaxTM Kit D腺病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建含TLP基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad5-TLP，體外感染三種不同來源成纖維細(xì)胞；③MTT法檢測實(shí)驗(yàn)組(Ad5-TLP)、陰性對(duì)照組(Ad5)和空白對(duì)照組各成纖維細(xì)胞的增殖，構(gòu)建成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)架FPCL比較增生性瘢痕成纖維細(xì)胞不同組的收縮指數(shù)；④在新生SD大鼠

3、背部線性切口模型與新西蘭大耳兔兔耳增生性瘢痕模型上進(jìn)行TLP基因治療，實(shí)驗(yàn)組注射構(gòu)建的重組腺病毒Ad5-TLP，分別采取2周、4周的鼠背瘢痕組織進(jìn)行HE染色后定量計(jì)算瘢痕組織面積，用游標(biāo)卡尺測量1周、2周、1月、3月的兔耳瘢痕組織的平均厚度，比較療效。 結(jié)果：⑴正常皮膚、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩組織學(xué)存在明顯差異；三種組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)無差異(P=0.9826)，Smad3、TLP mRNA表達(dá)具有顯著差異(PSmad

4、3=0.0017；PTLP=0.0380)；⑵成功構(gòu)建重組腺病毒Ad5-TLP，病毒顆粒物理滴度為5～6×1012opu/ml，純度1.3～1.5，病毒有效滴度為4.5×109 pfu/ml，陰性對(duì)照病毒有效滴度為7.5×109 pfu/ml；成纖維細(xì)胞感染Ad5-TLP組表達(dá)TLP明顯增高(P<0.01)；⑶各種組織成纖維細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的增殖無明顯的差異(P>0.05)；增生性瘢痕成纖維細(xì)胞感染Ad5-TLP后，F(xiàn)PCL凝膠塊

5、較對(duì)照組和空白組收縮更快(P<0.05)，而FPCL中未加入細(xì)胞的凝膠塊則沒有發(fā)生任何收縮；⑷成功構(gòu)建瘢痕動(dòng)物模型，術(shù)后2周時(shí)，SD大鼠實(shí)驗(yàn)組傷口的平均面積(12266±2755)較對(duì)照組平均面積(18794±3754)小(P<0.01)，術(shù)后1月實(shí)驗(yàn)組(11070±1490)與對(duì)照組(11790±1757)面積沒有明顯差異(P=0.2987)；兔耳瘢痕注射藥物后1周，腺病毒對(duì)照組的厚度全部較注射前增厚(-17.24±7.94％)，高濃

6、度TLP組(5.625×108 pfu/ml)部分較注射前增厚，效果不如空白對(duì)照組(P<0.05)；低濃度TLP組(5.625×107 pfu/ml)在1周、2周、1月時(shí)效果最佳，至3月時(shí)所有創(chuàng)面改善，四組之間沒有明顯的差異(P>0.05)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)從組織學(xué)與分子生物學(xué)兩種不同的角度證實(shí)了增生性瘢痕與瘢痕疙瘩的不同性質(zhì)，TGF-β信號(hào)通路中各種因子的表達(dá)水平直接影響瘢痕形成的方向和轉(zhuǎn)歸。腺病毒與過表達(dá)TLP基因均不影響正常