Myole過表達對足細(xì)胞功能的影響.pdf

1、研究背景:
　　 蛋白尿不僅是各種腎小球疾病最常見的臨床表現(xiàn)，同時也是腎小球濾過膜生理屏障受損的主要標(biāo)志。長期以來，人們對蛋白尿的發(fā)生機制缺乏深入的了解。
　　 近年來的研究顯示，腎小球性蛋白尿發(fā)生的根本原因在于腎小球濾過膜生理屏障受損，而腎小球上皮細(xì)胞（即足細(xì)胞）則是保持腎小球濾過膜功能完整性的關(guān)鍵因素。很多先天性腎病綜合征患者的發(fā)病是由于Nephrin、Podocin、α-Acitin-4、Synaptopodin等

2、基因的突變引起的，上述基因Knock-out的模型動物也出現(xiàn)了蛋白尿及腎小球上皮細(xì)胞足突融合等病變，表明這些表達在腎小球上皮細(xì)胞的足突分子（如Nephrin、Podocin、CD2AP、TRPC6）及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白（如Synaptopodin、α-Acitin-4、Podocalyxin等）對維持腎小球濾過膜完整性、阻止血漿蛋白漏出起著重要作用。足細(xì)胞可以通過細(xì)胞F-actin的收縮與擴張調(diào)整自身形態(tài)，改變細(xì)胞之間的濾過間隙和超濾系數(shù)

3、從而適應(yīng)腎小球濾過容積的改變，這一功能的完成主要依賴于其強大的細(xì)胞骨架系統(tǒng)，而Ⅰ型肌球蛋白的功能與細(xì)胞骨架密切相關(guān)。前期的研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型肌球蛋白分子中Myole是斑馬魚、小鼠乃至人類腎小球上皮細(xì)胞的重要組成成分，與足細(xì)胞的生理功能密切相關(guān);Myole基因敲除的斑馬魚及小鼠出現(xiàn)蛋白尿以及慢性腎損害癥狀，腎小球濾過膜的結(jié)構(gòu)及其功能的完整性發(fā)生顯著破壞;我們的前期通過體外Knock-down小鼠足細(xì)胞Myole后發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞的增值、黏附、抗損

4、傷能力及內(nèi)吞作用受損;提示腎小球上皮細(xì)胞中Myole分子的存在對腎小球濾過膜的結(jié)構(gòu)及功能的完整性是不可或缺的。
　　 目的:
　　 為研究Myole表達變化對足細(xì)胞功能及其相關(guān)機制的影響，本研究通過體外過表達Myole，觀察其對足細(xì)胞功能的影響。
　　 方法:
　　 1)小鼠腎小球足細(xì)胞培養(yǎng)。
　　 2)細(xì)胞免疫熒光法鑒定足細(xì)胞及細(xì)胞骨架蛋白。
　　 3)根據(jù)上海吉瑪公司設(shè)計的過表達質(zhì)粒對

5、足細(xì)胞進行瞬時轉(zhuǎn)染，并設(shè)立空白組及空載組。
　　 4) RT-PCR方法從mRNA水平，檢測基因過表達效果，以β-actin作為內(nèi)參基因，相對定量方法分析基因表達差異。
　　 5)應(yīng)用Western-blot方法從蛋白水平，檢測基因過表達效果，以β-actin作為內(nèi)參基因，經(jīng)過Image J軟件分析，半定量分析蛋白表達的差異。
　　 6)細(xì)胞免疫熒光法檢測各處理組足細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 7)細(xì)胞免疫熒光

6、法檢測Myole過表達后足細(xì)胞骨架蛋白的變化。
　　 8) ELISA法檢測各個實驗組Myole蛋白表達情況，分別設(shè)定4個實驗點，即24小時、48小時、72小時、96小時，檢測細(xì)胞的OD值。
　　 9) Transwell小室評估各個處理組細(xì)胞遷移能力。
　　 10)用50ug/ml的PAN（嘌呤霉素）處理各組細(xì)胞后，培養(yǎng)48小時后，計數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 11)消化后各處理組細(xì)胞后以相同密度

7、接種于六孔板中，37℃孵育1小時后，倒掉培養(yǎng)基，細(xì)胞計數(shù)，觀察黏附能力。
　　 12)各處理組細(xì)胞用FITC-Transferrin培養(yǎng)液孵育后，觀察細(xì)胞內(nèi)吞作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.Myole主要分布于足細(xì)胞胞漿，且向周邊聚集。CD2AP和Synaptopodin作為鑒定足細(xì)胞的蛋白分子，可見足細(xì)胞內(nèi)有明顯特異的表達。
　　 2.RT-PCR檢測mRNA的相對表達變化:Myole過表達組與空白組有

8、差異P=0.033;空載組與空白組無明顯差異，P=0.731。
　　 3.Western-blot檢測蛋白的相對表達變化:Myole過表達組與空白組有差異P=0.04;空載組與空白組無明顯差異，P=0.1994。
　　 4.Myole過表達后，免疫熒光法檢測細(xì)胞中熒光變化情況，過表達組細(xì)胞熒光強度稍強于其他組，且Myole蛋白胞漿分布增多。
　　 5.ELISA法檢測各組Myole蛋白表達情況:隨著時間的延長，過

9、表達組Myole蛋白含量下降緩慢，而空白組和空載組Myole蛋白含量下降明顯。
　　 6.不同處理組骨架蛋白F-actin的變化:Myole過表達組足細(xì)胞F-actin細(xì)胞定位并未發(fā)生改變，同時過表達組足細(xì)胞F-actin增加并不十分明顯。
　　 7.足細(xì)胞體外Transwell遷移實驗:在400倍顯微鏡下計數(shù)Transwell膜底面的遷移細(xì)胞數(shù);空白組細(xì)胞遷移數(shù)為141±7.582個，Myole過表達組足細(xì)胞遷移數(shù)17

10、9±4.301個，空載組細(xì)胞遷移數(shù)138±5.916個，經(jīng)過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)過表達組與空白組之間P＜0.01，具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異;而空白組與空載組之間P＞0.05，無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 8.足細(xì)胞黏附實驗:37℃孵育1小時，計數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示過表達組細(xì)胞黏附能力增加，400倍顯微鏡下計數(shù)結(jié)果顯示，空白組細(xì)胞數(shù)均值為27.6667±4.3805個，空載組細(xì)胞數(shù)均值為26.0833±4.2525個，Myole過表達組為5

11、2.1667±5.7340個，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果分析表明，過表達組與空白組之間P＜0.01，具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異;而空白組與空載組之間P＞0.05，無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 9.足細(xì)胞分離實驗:不同處理組足細(xì)胞經(jīng)過PAN作用48小時后，計數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)?？瞻捉M貼壁細(xì)胞數(shù)為59.4±4.6152個，空載組貼壁細(xì)胞數(shù)為56.8±3.5637個，過表達組為80.6±4.5607個;統(tǒng)計學(xué)結(jié)果分析表明，過表達組與空白組之間P＜0.01，具有明顯統(tǒng)計

12、學(xué)差異;而空白組與空載組之間P＞0.05，無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 10.足細(xì)胞內(nèi)吞作用檢測，免疫熒光結(jié)果顯示過表達組細(xì)胞較空白組細(xì)胞內(nèi)吞作用增強，而空白組與空載組細(xì)胞熒光強度相差不大。
　　 結(jié)論:
　　 1.Myole在足細(xì)胞的生長過程中，參與了足突的形成。
　　 2.Myole在維持足細(xì)胞的正常形態(tài)發(fā)揮重要作用。
　　 3.Myole過表達后足細(xì)胞的增值能力，黏附能力，抗損傷能力及內(nèi)吞作用增