Culin-5表達(dá)下調(diào)對(duì)足細(xì)胞形態(tài)及增殖功能的初步影響.pdf

1、背景：腎小球性蛋白尿發(fā)生的根本原因是由于腎小球?yàn)V過(guò)屏障受損,而腎小球上皮細(xì)胞則是保持腎小球?yàn)V過(guò)膜功能完整的關(guān)鍵因素。近十余年來(lái)的眾多研究發(fā)現(xiàn),很多先天性腎病綜合征患者的發(fā)病是由于Nephrin、Podocin、α-Actinin-4、Synaptopodin、WT-1等蛋白質(zhì)的編碼基因突變引起的。上述基因Knock-out的模型動(dòng)物也出現(xiàn)了蛋白尿及腎小球上皮細(xì)胞足突融合等病變,表明這些表達(dá)在腎小球上皮細(xì)胞的足突分子(如Nephrin、P

2、odocin、CD2AP、TRPC6)及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(如Synaptopodin、α-Actinin-4、Podocalyxin等)對(duì)維持腎小球?yàn)V過(guò)膜完整性、阻止血漿蛋白漏出起著重要作用。本研究小組近年來(lái)的研究也發(fā)現(xiàn),Nephrin、Podocin、CD2AP等足突分子的表達(dá)及調(diào)控變化確實(shí)與部分中國(guó)原發(fā)性腎病綜合征患兒的發(fā)病密切相關(guān)。同時(shí)我們還證實(shí),Myole(一種肌球蛋白Ⅰ類分子)也是人、小鼠腎小球上皮細(xì)胞的骨架相關(guān)蛋白,其表達(dá)K

3、nock-down后斑馬魚可出現(xiàn)蛋白尿及腎小球上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。所有細(xì)胞的蛋白質(zhì)都需要代謝和更新,真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)和降解主要有兩個(gè)途徑:溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UbiquitinProteasome System,UPS)。UPS由泛素、26S蛋白酶體、泛素活化酶E1s、泛素交聯(lián)酶E2s、泛素連接酶E3s等組成,是高效、特異的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng),是細(xì)胞調(diào)控特定蛋白質(zhì)、去除錯(cuò)誤折疊蛋白的主要機(jī)制。泛素連接酶E3s的主要作用是識(shí)別

4、特定的需要被降解的靶蛋白,并把泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白上,最后通過(guò)蛋白酶降解靶蛋白。Cullin-5(CUL5)是很多E3s-CRL的組分,參與多種靶蛋白(如p53)的降解。其編碼基因(位于11q22-23)序列與精氨酸加壓素激活鈣轉(zhuǎn)運(yùn)受體-1(VACM-1)高度同源,所以這兩者可能是同一種蛋白。迄今為止,已知CUL5／VACM-1的功能是：CUL5作為Backbone組裝E3s,參與真核細(xì)胞胞內(nèi)眾多蛋白質(zhì)的泛素化修飾及特異性降解；作為主要表達(dá)

5、在血管內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白質(zhì),VACM-1在多個(gè)細(xì)胞株都表達(dá)出抑制細(xì)胞增殖的活性,具抗腫瘤效應(yīng)。我們的前期研究表明,CUL5在人、小鼠腎小球上皮細(xì)胞有表達(dá),其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致模式動(dòng)物斑馬魚出現(xiàn)蛋白尿。我們分析,CUL5表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致蛋白尿的機(jī)制可能與由此導(dǎo)致的以CUL5為基石的UPS功能異常,并最終引起足突分子及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的代謝、轉(zhuǎn)換和更新機(jī)制失調(diào)有關(guān)。
　　 目的：研究CUL5敲低之后,小鼠的腎小球足細(xì)胞的形態(tài)和增殖的變化。闡明

6、CUL5在維持足突分子和腎小球?yàn)V過(guò)屏障的功能中可能發(fā)揮的關(guān)鍵作用。
　　 方法：⑴小鼠腎小球足細(xì)胞培養(yǎng)。⑵細(xì)胞免疫熒光法鑒定足細(xì)胞及細(xì)胞骨架蛋白。⑶miRNA設(shè)計(jì),針對(duì)CUL5的4個(gè)不同序列,分別設(shè)計(jì)四個(gè)質(zhì)粒和一個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒。由Invitrogen公司合成。⑷使用Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑,對(duì)足細(xì)胞中的CUL5基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,敲低CUL5表達(dá)。⑸應(yīng)用RT-PCR方法來(lái)從mRNA水平,檢測(cè)基因敲低的效果,以GAPDH作為內(nèi)

7、參基因,經(jīng)過(guò)Geo-plo-Analyzer4.0軟件,分析凝膠電泳后圖片,半定量分析基因表達(dá)差異。⑹應(yīng)用Western—blot方法從蛋白水平,檢測(cè)基因敲低的效果,以β-actin作為內(nèi)參基因,經(jīng)過(guò)Image J軟件分析,半定量分析蛋白表達(dá)的差異。⑺細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)CUL5敲低之后足細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。⑻細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)CUL5敲低之后細(xì)胞骨架蛋白的變化。⑼MTT法檢測(cè)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖情況,分別設(shè)定4個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),即24小時(shí)、48小

8、時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí),檢測(cè)細(xì)胞的OD值。
　　 結(jié)果：①小鼠足細(xì)胞,在33℃允許條件(permissive condition)下,增殖狀態(tài)下的足細(xì)胞呈“鵝卵石”樣。胞核呈圓形,位于胞體中央,足突較少較短；在轉(zhuǎn)入37℃非允許條件(non-permissive condition)下,培養(yǎng)約14天的時(shí)間,足細(xì)胞分化成熟,胞質(zhì)向四周伸展,形狀不規(guī)則,有大量較長(zhǎng)較細(xì)的足突形成,細(xì)胞呈“樹枝”狀。Nephrin作為鑒定足細(xì)胞內(nèi)蛋白分子

9、。②33℃允許條件下的足細(xì)胞,CUL5分布范圍:主要集中在足細(xì)胞核膜的周圍。37℃非允許條件下的足細(xì)胞,CUL5分布在細(xì)胞的胞漿和足突處。③33℃允許條件下的足細(xì)胞,F-actin分布范圍:主要集中在足細(xì)胞主突附近；37℃非允許條件下的足細(xì)胞,F-actin呈放射狀,伸展至新生的突起中。④經(jīng)過(guò)RNAi技術(shù)后,敲低CUL5,經(jīng)過(guò)RT-PCR的檢測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)變化:干擾一組(P=0.003)、二組(P=0.042)、三組(P=0.00

10、0)、四組(P=0.000)與對(duì)照組有差異P<0.05；陰性對(duì)照組與對(duì)照組無(wú)明顯差異,P=0.091。⑤敲低CUL5后,用Western-blot檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)變化:干擾一組、二組、三組、四組與對(duì)照組有差異P<0.05;陰性對(duì)照組與對(duì)照組無(wú)明顯差異,P=0.051。⑥敲低CUL5之后,免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中熒光變化的情況,各個(gè)干擾組細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯變?nèi)?而對(duì)照組和陰性對(duì)照組的熒光強(qiáng)度相差不大。⑦敲低CUL5之后,足細(xì)胞形態(tài)上的變化:細(xì)