α-Actinins對足細(xì)胞運(yùn)動性的影響機(jī)制.pdf

1、第一部分α-Actinins在足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),運(yùn)動性和牽拉力中的作用
　　目的:觀察α-actinins基因敲低及突變后足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化及對足細(xì)胞運(yùn)動性和牽拉力的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)條件永生化的野生型及α-actinin-4 K256E基因雜合和純合突變型足細(xì)胞。利用慢病毒轉(zhuǎn)染RNA干擾技術(shù)敲低野生型足細(xì)胞中α-actinin-1和α-actinin-4的表達(dá);應(yīng)用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效果;免疫熒光觀察

2、細(xì)胞形態(tài),α-actinins及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)F-actin的分布變化;傷口愈合實(shí)驗(yàn)用于檢測細(xì)胞的運(yùn)動性;牽拉力學(xué)顯微鏡用于檢測細(xì)胞的牽拉力。
　　結(jié)果:Western Blot結(jié)果顯示慢病毒轉(zhuǎn)染小干擾RNA技術(shù)可高效敲低α-actinin-1和α-actinin-4基因。α-Actinin-1和α-actinin-4基因敲低后,細(xì)胞骨架出現(xiàn)紊亂,細(xì)胞的牽拉力增加,而且細(xì)胞的運(yùn)動性也增加。相反,α-actinin-4突變型的足細(xì)胞表

3、現(xiàn)為牽拉力下降,運(yùn)動性降低。
　　結(jié)論:α-Actinins參與細(xì)胞骨運(yùn)動性。α-Actinin-4突變的足細(xì)胞可獲得架結(jié)構(gòu)重排和牽拉力形成,可調(diào)節(jié)足細(xì)胞的收縮力和限制細(xì)胞的某些功能而降低了細(xì)胞的牽拉力和運(yùn)動性。這表明α-actinins功能的改變可能通過改變足細(xì)胞的牽拉力和運(yùn)動性造成腎小球損傷。
　　第二部分α-Actinins基因敲低或突變對足細(xì)胞黏著斑的影響
　　目的:觀察體內(nèi)外α-actinins基因敲低及突變

4、后對細(xì)胞間黏附分子vinculin和β3 integrin mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。
　　方法:間接免疫熒光法檢測α-actinin-1和α-actinin-4敲低后vinculin,F-actin的表達(dá)分布變化,及活性β3 integrin在野生型,α-actinin-4基因敲除,及α-actinin-4 K256E基因雜合和純合突變型小鼠中的表達(dá)變化。實(shí)時定量PCR及Western Blot檢測vinculin在α-ac

5、tinins基因敲低及突變型足細(xì)胞中mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。另外,實(shí)時定量PCR也檢測了β3 integrin在上述幾種細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:Vinculin在α-actinin-4基因敲低足細(xì)胞中mRNA及蛋白表達(dá)水平均有增高,但在α-actinin-1基因敲低和α-actinin-4突變足細(xì)胞中表達(dá)無明顯變化。β3 Integrin在α-actinin-4突變型足細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平明顯下降。在α-

6、actinin-4基因敲除小鼠腎組織中,活性β3 integrin表達(dá)增加,而在α-actinin-4雜合型和純合型突變的小鼠腎組織中,活性β3 integrin的表達(dá)下降。
　　結(jié)論:α-Actinin-4敲低可影響vinculin的表達(dá),而α-actinin-4基因敲除和突變可明顯影響小鼠腎臟活性β3 integrin的表達(dá)。這表明α-actinins可影響足細(xì)胞黏著斑的表達(dá)。
　　第三部分α-Actinins基因敲低或

7、突變對小GTP酶活性的影響
　　目的:觀察α-actinins基因敲低及突變后對小GTP酶活性的影響,同時觀察野生型,α-actinin-4 K256E基因雜合和純合突變小鼠腎臟中小GTP酶活性的變化。
　　方法:利用小GTP酶活性試劑盒檢測α-actinins基因敲低及突變型足細(xì)胞中RhoA, Rac1和Cdc42的活性,并同時檢測野生型,α-actinin-4基因雜合及純合型突變小鼠腎臟裂解液中上述三種小GTP酶的活性。

8、
　　結(jié)果:在α-actinin-4基因敲低細(xì)胞中,RhoA活性顯著下降,Cdc42的活性明顯增高,而Rac1活性則無明顯變化。在α-actinin-1基因敲低細(xì)胞中,RhoA活性也有所增加,Rac1和Cdc42活性則無變化。在α-actinin-4基因突變細(xì)胞中,雜合型和純合型α-actinin-4細(xì)胞中RhoA活性均有所增加,而Rac1和Cdc42活性則無變化。同時純合型α-actinin-4突變小鼠腎臟中RhoA活性也有所增