中樞性BMP9過表達(dá)對(duì)肝糖代謝影響及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：BMP9在小鼠下丘腦的表達(dá)和分布
　　目的：檢測(cè)BMP9基因在普食（NCD）和高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠及db/db鼠下丘腦分布。
　　方法：利用 Western blot技術(shù)檢測(cè)普食和高脂喂養(yǎng)的12周后C57BL/6J以及普食喂養(yǎng)12周后 db/db鼠NCD組、HFD組、db/db組，均n=4）下丘腦BMP9基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果：高脂 C57BL/6J小鼠下丘腦 BMP9蛋白較普食組明

2、顯下降（P＜0.05），db/db鼠下丘腦BMP9蛋白較普食組明顯下降（P＜0.01）。
　　結(jié)論：高脂飲食和肥胖降低下丘腦BMP9蛋白水平。
　　第二部分：中樞性BMP9過表達(dá)對(duì)小鼠肝糖代謝影響
　　目的：側(cè)腦室給予普食（NCD）和高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠Ad-BMP9或Ad-GFP，初步探討中樞性BMP9過表達(dá)對(duì)小鼠肝臟葡萄糖代謝的影響。
　　方法：7周齡健康雄性 C57BL/6J小鼠90

3、只，分別適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為普食喂養(yǎng)組（ND組，n=40）和高脂喂養(yǎng)組（HFD組，n=40），均喂養(yǎng)12周。于12周末分別隨機(jī)側(cè)腦室注射 Ad-BMP9或Ad-GFP，分為普食空載組（NCD+Ad-GFP組, n=20），普食BMP9病毒組（NCD+Ad-BMP9組，n=20），高脂空載病毒組（HFD+Ad-GFP組，n=20）,高脂BMP9病毒組（HFD+Ad-BMP9組，n=20）。利用Western blot檢測(cè)測(cè)BMP9蛋

4、白表達(dá)水平。測(cè)定空腹/餐后血糖、攝食及體重變化、血壓、血漿甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、呼吸商等，利用腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)、胰島素耐量試驗(yàn)（ITT）、高胰島素-正葡萄糖鉗夾及組織葡萄糖攝取試驗(yàn)評(píng)價(jià)各組小鼠肝糖代謝、胰島素敏感和組織葡萄糖攝取能力變化。
　　結(jié)果：普食組給予Ad-BMP9后下丘腦BMP9蛋白水平顯著升高，高脂組給予 A

5、d-BMP9后下丘腦 BMP9蛋白水平也顯著增加。NCD+Ad-BMP9組與NCD+Ad-GFP組相比，小鼠血糖、攝食及體重、血壓、血漿TG、TC、FFA、ASL、ALT水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；HFD+Ad-GFP組較 NCD+Ad-GFP組小鼠上述指標(biāo)均明顯升高（P＜0.05）；HFD+Ad-BMP9組較HFD+Ad-GFP組小鼠體重、攝食、餐后血糖、收縮壓、舒張壓、血漿TG、TC、FFA水平顯著升高（P＜0.05），但ALT、AST水平

6、兩組相比無(wú)明顯差異。NCD+Ad-BMP9組與 NCD+Ad-GFP組小鼠相比，RER、VO2無(wú)明顯差異；而 HFD+Ad-BMP9組較HFD+Ad-GFP組小鼠 VO2顯著升高（P＜0.05），RER較 HFD+Ad-GFP組降低（P＜0.05）。在鉗夾穩(wěn)態(tài)期，NCD+Ad-BMP9組與NCD+Ad-GFP組小鼠相比，葡萄糖輸入率（GIR）、葡萄糖清除率(GRd)及肝糖生成（HGP）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而 HFD+Ad-B

7、MP9組較HFD+Ad-GFP組小鼠 GIR、GRd顯著升高（P＜0.01），HGP則顯著下降（P＜0.01）。NCD+Ad-BMP9組與 NCD+Ad-GFP組小鼠相比，脂肪組織和肌肉組織葡萄糖攝取無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而HFD+Ad-BMP9組較 HFD+Ad-GFP組小鼠脂肪組織葡萄糖攝取無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），肌肉組織葡萄糖攝取顯著升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：中樞性 BMP9改善飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗和降

8、低外周肝糖產(chǎn)生。
　　第三部分：中樞性BMP9基因過表達(dá)對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠下丘腦相關(guān)信號(hào)通路和肝糖異生酶的影響
　　目的：通過檢測(cè)側(cè)腦室給予的Ad-GFP或Ad-BMP9的普食和高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟糖異生關(guān)鍵酶和下丘腦胰島素信號(hào)通路包括胰島素受體（InsR）、和蛋白激酶B（AKT）以及下丘腦雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和p70核糖體蛋白S6激酶（p70S6K），研究中樞性BMP9基因過表達(dá)對(duì)下丘腦胰島素信號(hào)通路及mTOR信號(hào)通路和肝臟

9、糖異生酶的影響。
　　方法：20只C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為普食喂養(yǎng)組（NCD組，n=10）和高脂喂養(yǎng)組（HFD組，n=10），均喂養(yǎng)12周。于12周末分別隨機(jī)側(cè)腦室注射 Ad-BMP9或 Ad-GFP，分為普食空載組（NCD+Ad-GFP組, n=5），普食BMP9病毒組（NCD+Ad-BMP9組，n=5），高脂空載病毒組（HFD+Ad-GFP組，n=5）,高脂BMP9病毒組（HFD+Ad-BMP9組，n=5）；利用實(shí)時(shí)的熒

10、光定量PCR檢測(cè)各組小鼠側(cè)腦室給予腺病毒后第7天下丘腦NPY、AgRP、POMC的mRNA，利用Western blot檢測(cè)下丘腦InsR、AKT、mTOR、p70S6K和肝臟PEPCK、G6Pase的蛋白表達(dá)，利用免疫組化各組小鼠下丘腦c-fos水平。利用免疫熒光檢測(cè)各組在基礎(chǔ)狀態(tài)下和胰島素刺激下下丘腦弓狀核PIP3的形成情況。
　　結(jié)果：NCD+Ad-BMP9組與 NCD+Ad-GFP組小鼠相比，下丘腦NPY、AgRP、POM

11、C的 mRNA表達(dá)均無(wú)明顯差異（P＞0.05）;HFD+Ad-BMP9組小鼠下丘腦NPY mRNA表達(dá)顯著低于HFD+Ad-GFP組（P＜0.01），下丘腦POMC mRMA顯著高于HFD+Ad-GFP（P＜0.01），而下丘腦AgRP mRNA兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。NCD+Ad-BMP9組與 NCD+Ad-GFP組小鼠相比下丘腦 InsR、AKT、mTOR、p70S6K蛋白磷酸化水平及肝臟PEPCK、G6Pase mRNA

12、和蛋白水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；HFD+Ad-BMP9組小鼠下丘腦 InsR、AKT、p70S6K蛋白磷酸化水平顯著高于 HFD+Ad-GFP組（P＜0.05或 P＜0.01），肝臟PEPCK、G6PAse mRNA和蛋白水平均顯著低于 HFD+Ad-GFP組（P＜0.05或P＜0.01）。NCD+Ad-BMP9組和NCD+Ad-GFP組小鼠下丘腦有 c-fos表達(dá)，以室旁核最為密集，但兩組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；HF

13、D+Ad-BMP9組小鼠下丘腦室旁核Fos免疫反應(yīng)性陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目較HFD+Ad-GFP組顯著增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高脂飲食下，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，Ad-BMP9組與 Ad-GFP組下丘腦 ARC的中度和高度PIP3形成有所增加，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＞0.05），而在胰島素刺激下，Ad-BMP9組較Ad-GFP組下丘腦ARC的PIP3形成明顯增加（P＜0.05）。
　　結(jié)論：在普食狀態(tài)下，中樞性 BMP9基因過表達(dá)對(duì)小鼠下